Hier presenteren we een protocol voor de ontwikkeling en de karakterisering van een zebravismodel van epilepsie als gevolg van de voorbijgaande remming van het DEPDC5-gen.
Epilepsie is een van de meest voorkomende neurologische aandoeningen, die wereldwijd naar schatting 50 miljoen mensen treft. Recente ontwikkelingen in genetisch onderzoek hebben een groot spectrum van genen blootgelegd die betrokken zijn bij verschillende vormen van epilepsie, wat de heterogene aard van deze aandoening benadrukt. Geschikte diermodellen zijn essentieel voor het onderzoeken van de pathologische mechanismen die worden veroorzaakt door genetische mutaties die betrokken zijn bij epilepsie en voor het ontwikkelen van gespecialiseerde, gerichte therapieën. In de afgelopen jaren is zebravis naar voren gekomen als een waardevol gewerveld organisme voor het modelleren van epilepsieën, met het gebruik van zowel genetische manipulatie als blootstelling aan bekende epileptogene geneesmiddelen, zoals pentylenetetrazole (PTZ), om nieuwe anti-epileptische therapieën te identificeren. Schadelijke mutaties in de mTOR-regulator DEPDC5 zijn geassocieerd met verschillende vormen van focale epilepsieën en knock-down van de zebravisortholoog veroorzaakt hyperactiviteit geassocieerd met spontane epileptische episodes, evenals verbeterde elektrografische activiteit en karakteristiek draaiwielzwemmen. Hier beschreven we de methode die betrokken is bij het genereren van het DEPDC5-functieverliesmodel en illustreren we het protocol voor het beoordelen van motorische activiteit op 28 en 48 uur na bevruchting (hpf), evenals een methode voor het registreren van veldactiviteit in het zebravisoptische tectum. Een illustratie van het effect van het epileptogene medicijn PTZ op neuronale activiteit in de loop van de tijd wordt ook gegeven.
Vanwege zijn kleine omvang, eileiderontwikkeling en transparantie in vroege stadia van ontwikkeling, is zebravis naar voren gekomen als een waardevol gewerveld organisme voor het modelleren van menselijke ziekten zo divers als cardiovasculaire, kanker of neurologische aandoeningen1,2. Zebravis combineert de voordelen van een gewerveld dier, waaronder het hoge behoud van orgaanarchitectuur en genetische code, met de kleine omvang en het gemak van genetische manipulatie van eenvoudigere modelorganismen, waardoor zowel fundamentele studies als translationele toepassingen worden vergemakkelijkt. Met name de toepasselijkheid voor geautomatiseerde screening van gedrag en fluorescerende markers van cellulaire processen met hoge doorvoer heeft zebravissen tot een bijzonder aantrekkelijk model voor epilepsieonderzoek gemaakt. Dit is aangetoond door een hoge toename in het laatste decennium van het aantal publicaties met chemisch geïnduceerde en / of genetische modellen van epilepsie3,4,5 en, meer recent, rapporten van veelbelovende therapieën verkregen uit chemische schermen in deze modellen6,7,8.
DEPDC5 is lid van het GATOR1-complex, een negatieve regulator van mTOR-signalering9. Mutaties in het DEPDC5-gen zijn voor het eerst ontdekt in 2013 in probands die lijden aan autosomaal dominante focale epilepsieën10,11en zijn sindsdien gemeld in een aantal klinische aandoeningen geassocieerd met focale epileptische manifestaties en focale corticale dysplasie12. De grote meerderheid van de gerapporteerde mutaties wordt voorspeld om het functieverlies van het gen12te veroorzaken , en dit werd formeel aangetoond voor een aantal DEPDC5 gemuteerde transcripten die het doelwit zijn van onzin gemedieerd mRNA-verval12,13. In overeenstemming, knock-down van de gen ortholoog in zebravissen met behulp van antisense morfolino oligonucleotiden (AMO’s) resulteert in een aantal kenmerken die gebruikelijk zijn voor epileptische modellen in dit organisme, waaronder hyperactiviteit, draaiwielachtig zwemmen, spontane aanvallen en verhoogde neuronale activiteit14,15,16,17,18. Interessant is dat behandeling met rapamycine, een remmer van mTOR-signalering, de gedragskenmerken van dit model18omkeerde , ter ondersteuning van de hypothese dat DEPDC5-functieverlies epilepsie kan veroorzaken als gevolg van een misregulatie van de mTOR-route9,19.
Transient knock-down van genexpressie in vivo met behulp van antisense oligonucleotiden die de morfolinomodificatie dragen, is een waardevol hulpmiddel geweest voor het bestuderen van de rol van specifieke genen, vergelijkbaar met si / shRNA-gebaseerde technieken. Onlangs hebben op AMO gebaseerde strategieën ook klinische toepassingen gevonden, met een eerste AMO-therapie die de FDA-goedkeuring ontving voor de behandeling van Duchenne spieratrofie in 201620. Hoewel werd gemeld dat bij zebravissen het fenotype van acute AMO-gebaseerde gen knock-down niet altijd correleert met de constitutieve knock-outmodellen21, kan dit op zijn minst in sommige gevallen te wijten zijn aan compenserende mechanismen veroorzaakt door constitutieve genetische modificaties22. De kwestie van de specificiteit van het AMO-geïnduceerde fenotype is echter een onbetwistbare zorg die zorgvuldig moet worden aangepakt in studies met deze technologie23. Om de specificiteit van het op AMO gebaseerde knock-down fenotype te waarborgen, zijn verschillende belangrijke controles nodig. Deze omvatten een dosis-responscurve die de selectie van de laagste dosis AMO mogelijk maakt die effectief is voor gen-knock-down, waardoor algehele toxiciteit wordt vermeden als gevolg van de introductie van een overmaat aan genetisch materiaal. Het gebruik van een Mismatch AMO die zich niet richt op een bepaald gebied in het genoom is ook vereist voor het vaststellen van een geschikte dosis en bij het identificeren van een specifiek fenotype. Een tweede AMO die zich richt op een ander gebied van hetzelfde gen, zoals een splice-blocking AMO, is nodig om te bevestigen dat het fenotype te wijten is aan de knock-down van het doelgen. Redding van het knock-down fenotype met het cDNA van het gen, hetzij de menselijke ortholoog of een codon-gemodificeerde versie van het zebravisgen die niet door de AMO kan worden aangevallen, biedt een sterk argument ten gunste van de fenotypespecificiteit. Gebrek aan redding met hetzelfde cDNA met functieverliesmutaties (zoals de introductie van een vroege stopcodons) is een verder bewijs in deze richting.
Hier presenteren we een methode voor het genereren van een zebravis DEPDC5 verlies-van-functie model en het protocol voor gedragsfenotypering op 28 en 48 h na bevruchting (hpf). Bij 28 hpf veroorzaakt de depdc5-functieverlies algehele hyperactiviteit, zoals blijkt uit verbeterde coiling- en twitching-bewegingen van de embryo’s in het chorion. Een geautomatiseerd bewegingsdetectiesysteem kan in dit stadium worden gebruikt om de totale activiteit per embryo te kwantificeren. Met 48 pkf vertonen zebravissen stereotiep ontsnappingszwemmen als reactie op aanraking. Bij zebravissen met gereguleerde expressie van DEPDC5is het zwemtraject aanzienlijk kronkeliger dan bij controles, de vis vertoont een “kurkschroef” of “draaiwiel” -achtig patroon, vergelijkbaar met andere gerapporteerde epilepsiemodellen in dit organisme3,4. Elektrofysiologische opnames werden verkregen in het optische tectum bij zebravislarven tussen 4-6 dagen na de bevruchting (dpf) en tonen een baseline toename van neuronale activiteit bij de DEPDC5 knock-down dieren. Het voordeel van dit model is dat het verschillende fenotypische kenmerken op verschillende tijdstippen presenteert, wat nuttig kan zijn bij het monitoren en beoordelen van de werkzaamheid van medicamenteuze therapieën tijdens de ontwikkeling.
Epilepsie is een complexe neurologische ziekte, met een breed scala aan etiologieën die beginnen te worden opgehelderd met de komst van genetische sequencingtechnologieën25,26,27. Veelzijdige diermodellen zijn essentieel voor een efficiënte translationele strategie die zowel inzichten zal opleveren in de pathologische mechanismen van genetisch verbonden epilepsieën, als gerichte therapieën voor de verschillende vormen van deze aandoening. Zebravismodellen zijn zeer effectief geweest in het reproduceren van belangrijke kenmerken van epilepsie en het bieden van betrouwbare uitlezingen voor anti-epileptische screening van geneesmiddelen5,28. Spontane aanvallen kunnen worden gedetecteerd bij genetisch gemodificeerde zebravissen15,29,30,31 en neurofysiologische analyse in deze modellen28 heeft de neuronale basis van het epileptisch-achtige gedrag bevestigd32,33. Kleine zebravislarven zijn vatbaar voor chemische schermen in 96-well-formaat met behulp van geautomatiseerde detectie van eenvoudig gedrag, zoals spontaan zwemmen, wat een snelle detectie van potentiële therapieën mogelijk maakt.
Het HIER gepresenteerde DEPDC5 knock-down model wordt verkregen door injectie van AMO in het zebravisembryo om genexpressie tijdens de ontwikkeling te blokkeren. Dit model presenteert verschillende keystone fenotypische kenmerken tijdens verschillende tijdstippen van larvale ontwikkeling, die kunnen worden gebruikt als indicatoren van therapie-efficiëntie tijdens een chemisch of genetisch screeningsprotocol. Het AMO-gemedieerde gen knock-down is een krachtige techniek, die voordelen biedt ten opzichte van chemisch geïnduceerde aanvalsmodellen, omdat het specifiek gericht is op de expressie van een gen van belang, waardoor de onderliggende pathogene mechanismen die worden veroorzaakt door een genetische mutatie kunnen worden geïdentificeerd. Chemische inductoren, die niettemin krachtige hulpmiddelen zijn voor medicijnscreenings, kunnen werken via meerdere cellulaire routes die mogelijk niet altijd relevant zijn voor de genetische mutatie die wordt bestudeerd. Hoewel AMO-injectie op zichzelf een eenvoudige techniek is wanneer deze door de experimentator wordt beheerst, biedt het ook een aantal beperkingen. De injecties moeten worden uitgevoerd in het embryo van het eencellige stadium; in onze handen verhoogden injecties in latere stadia de variabiliteit van het fenotype aanzienlijk. Dit beperkt de beschikbare tijd voor injectie; daarom is een strategie om eieren voor injectie in een tijdsvolgorde te genereren nuttig. We gebruiken routinematig 4-5 kruisen die we openen met intervallen van 15-20 minuten, waardoor de injectie van één koppeling mogelijk is voordat we de volgende verkrijgen. Verder moet ervoor worden gezorgd dat het fenotype op dezelfde tijdstippen tussen verschillende experimenten wordt beoordeeld, omdat stereotiep gedrag snel evolueert tijdens de eerste dagen van ontwikkeling. Het volume en de concentratie van AMO’s moeten ook zorgvuldig worden gecontroleerd, omdat algemene toxiciteit als gevolg van het injecteren van overmatige hoeveelheden het specifieke fenotype zal maskeren. De verschillende controles die in de inleiding worden gepresenteerd, zijn essentieel voor het bepalen van de juiste injectiedosis en het bijbehorende fenotype.
Veldopnamen van het larvale zebravisbrein zijn een nuttig hulpmiddel voor het onderzoeken van de schadelijke effecten van genetische mutaties die betrokken zijn bij verschillende hersenaandoeningen op de wereldwijde neuronale activiteit34. Depolarisatiegebeurtenissen die onder deze experimentele omstandigheden worden gezien, zijn een gevestigde methode voor het beoordelen van elektrofysiologische effecten van geneesmiddelen in verschillende epileptische omstandigheden15,35. De beoordeling van deze effecten is echter meestal kwalitatief gedaan in plaats van kwantitatief, en met een subjectieve waarnemer als actor in de analyse. Hier ontwikkelen we een automatische detectiestrategie die objectief de snelheid van depolarisaties, hun amplitude en duur kan kwantificeren en de voortgang van deze parameters in de loop van de tijd of met verschillende genetische of farmacologische interventies kan evalueren.
De hier gepresenteerde representatieve resultaten tonen de verwachte veldactiviteit van het DEPDC5 knock-down genetisch model in vergelijking met een Mismatch-controle bij 4-6 dpf zebravissen, voor en na de toepassing van PTZ om epileptiform-achtige elektrografische activiteit te introduceren. Eerder hebben we een significante toename van de basale activiteit van de DEPDC5 knockdown-toestandaangetoond 18. Hier laten we zien dat de respons van deze twee aandoeningen op PTZ, een chemische epileptiforme activiteitsinductor, een vergelijkbaar traject in de tijd heeft, beginnend met een periode van relatief lage frequentie, hoge amplitude depolarisatiegebeurtenissen en doorgaand met een periode van hogere frequentie, lagere amplitude depolarisatiegebeurtenissen. Veldopnamegebeurtenissen hebben een langzame dynamiek (frequenties van belang liggen in het bereik van 0,005-0,2 s-1), daarom worden zowel low-pass als high-pass filters in dit protocol gebruikt om de gebeurtenissen van belang te isoleren. Na het elimineren van de laagfrequente ruis, wordt de detectie van depolarisatiegebeurtenissen uitgevoerd met behulp van een eenvoudige drempel. Aangezien de statistieken van het signaal sterk worden beïnvloed door de aanwezigheid van depolarisatiegebeurtenissen, konden we de standaarddeviatie van het totale signaal niet gebruiken om deze drempel te bepalen. De variabiliteit van de waarde van de standaarddeviatie tussen datasets was groter dan de waargenomen opnameruisniveaus. Daarom hebben we na visuele inspectie van de sporen een vaste waarde van de drempel van 0,3 mV gebruikt om de vertekening veroorzaakt door verschillende niveaus van depolarisatieactiviteit te voorkomen.
Het beschreven protocol biedt een gestandaardiseerde en eenvoudige methode voor het evalueren van het motorische gedrag en de neuronale veldactiviteit, via extracellulaire stroomklemspanningsregistratie in combinatie met automatische detectie van depolarisatiegebeurtenissen in het optische tectum, om epileptiform-achtige fenotypen in zebravismodellen te karakteriseren.
The authors have nothing to disclose.
We willen graag de medewerkers van het ICM-elektrofysiologisch platform bedanken waar de neurofysiologische experimenten werden uitgevoerd. We bedanken ook Anca Marian voor de technische hulp. SC werd ondersteund door de Trampoline Grant #21488. EK werd ondersteund door de AFM Grant #18469 en ERC Consolidator Grant (ALS-Networks). HC werd ondersteund door PhD-prijzen van de Fondation pour la Recherche Médicale (PLP20141031462) en ARSLA. Voor AD en RM werd dit werk ondersteund door drie subsidies van de Roemeense nationale autoriteit voor wetenschappelijk onderzoek en innovatie, CNCS-UEFISCDI (projectnummers PN-III-P4-ID-PCE-2016-0010, PN-III-P2-2.1-PED-2016-0007 en COFUND-NEURON-NMDAR-PSY), een subsidie van het Horizon 2020 onderzoeks- en innovatieprogramma van de Europese Unie – subsidieovereenkomst nr. 668863-SyBil-AA, en een subsidie van de National Science Foundation NSF-IOS-1656830 gefinancierd door de Amerikaanse overheid.
Agarose | Sigma-Aldrich, France | A9539 | |
Aquarium salt | Instant Ocean, Blacksburg, VA | SS15-10 | |
Borosilicate glass with filament | Sutter Instruments | BF100-50-10 | OD: 1,5mm, ID: 0,5 mm |
CaCl2 | Sigma-Aldrich, France | C1016 | |
Depdc5-atg antisense morpholino | GeneTools, OR, USA | N/A | sequence 5’- TGCCTTCATGGTGACCGTCATTTTA -3’ |
Depdc5-mis antisense morpholino | GeneTools, OR, USA | N/A | sequence 5’- TGCgTTgATcGTGACCcTgATTTTA -3’ |
Depdc5-splice antisense morpholino | GeneTools, OR, USA | N/A | sequence 5’- ACATTCCTGTTTCACCATAGATGAT -3’ |
Digitizer | Molecular Devices, CA, USA | Digidata 1550 | |
Fast Green Dye | Sigma-Aldrich, France | F7258 | Stock solution of 0.2% |
Glass-bottom petri dishes | Ibidi, Germany | 81218 | |
glucose | Sigma-Aldrich, France | 68270 | |
Grasshopper 2 camera | FLIR, BC, Canada | GRAS-03K2M-C | formerly Point Grey Research |
HEPES | Sigma-Aldrich, France | H3375 | |
human wild-type DEPDC5 cDNA | Dharmacon, France | NM_001242897.1 | Accession: BC144291 Clone ID 905 |
ImageJ software | NIH, USA | N/A | |
KCl | Sigma-Aldrich, France | P9333 | |
Matlab software | MathWorks, MA, USA | N/A | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich, France | M2670 | |
NaCl | Sigma-Aldrich, France | S7653 | |
NaOH | Sigma-Aldrich, France | 71687 | |
Pancuronium bromide | Alomone Labs | P-130 | Stock solution of 60mM in water |
Parafilm | Sigma-Aldrich, France | P7793 | |
Patch clamp amplifier | Molecular Devices, CA, USA | MultiClamp 700B | Computer-controled patch clamp amplifier |
pClamp10 acquisition software | Molecular Devices | N/A | |
Pentylenetetrazol (PTZ) | Sigma-Aldrich, France | P6500 | Stock solution of 300mM (dissolved in recording solution) |
Pipette puller | Narishige, Japan | PC-10 | |
Pneumatic PicoPump | WPI, France | PV 820 | |
Sylgard 184 kit | Sigma-Aldrich Intl. | 761036 | |
Transfer plastic pipettes | Sigma-Aldrich, France | Z350605 | |
Zebralab | Viewpoint, France | N/A |