Esperimenti di Bilayer del lipido con contatto bolla lipidici per Patch-affrancate

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per la formazione di lipidici utilizzando un metodo di doppio strato di contatto bolla. Una bolla di acqua è soffiata in un solvente organico, per cui un monostrato è formato all’interfaccia acqua-olio. Due pipette sono manipolati per ancorare le bolle per formare un doppio strato.

Abstract

Lipidici forniscono un’unica piattaforma sperimentale per studi funzionali dei canali ionici, che consente l’esame delle interazioni di canale-membrana sotto membrana varie composizioni lipidiche. Tra loro, il bilayer interfaccia gocciolina ha guadagnato popolarità; Tuttavia, la dimensione grande membrana ostacola la registrazione del rumore di fondo elettrico basso. Abbiamo stabilito un metodo di contatto bolla doppio strato (CBB) che combina i vantaggi del doppio strato lipidico planare e metodi di patch-clamp, ad esempio la possibilità di variare la composizione lipidica e di manipolare la meccanica a doppio strato, rispettivamente. Utilizzando il programma di installazione per esperimenti di patch-clamp convenzionali, esperimenti basati su gancio di traino possono essere eseguiti facilmente. In breve, una soluzione elettrolitica in una pipetta di vetro è soffiata in una fase di solvente organica (esadecano), e la pressione di pipetta viene mantenuta per ottenere una dimensione di bolla stabile. La bolla spontaneamente è fiancheggiata da un monostrato lipidico (lipidi puri o misto di lipidi), che è fornito da liposomi nelle bolle. Successivamente, le due monostrato-foderato bolle (~ 50 µm di diametro) sulla punta delle pipette di vetro vengono ancorate per formazione di doppio strato. Introduzione di liposomi ricostituiti canale nella bolla conduce all’incorporazione di canali in doppio strato, consentendo per la registrazione corrente di singolo canale con un rapporto segnale-rumore paragonabile a quella delle registrazioni di patch-clamp. CBB con una composizione asimmetrica del lipido sono prontamente formate. Il gancio di traino è rinnovato ripetutamente che soffia le bolle precedenti e formando nuovi. Varie perturbazioni fisiche e chimiche (ad es., aspersione di membrana e doppio strato tensione) possono essere imposto il CBB. qui, vi presentiamo la procedura di base per la formazione di CBB.

Introduction

Per i canali ionici, la membrana cellulare non è semplicemente un materiale di supporto, ma un partner per generare il flusso di ioni. Funzionalmente, la membrana è un isolante elettrico in cui ioni canali vengono incorporati, e tutte le membrane cellulari sono impartite con un potenziale di membrana di riposo. Convenzionalmente, un potenziale di membrana arbitrario è stato imposto da un circuito esterno mediante il quale è stata misurata la corrente elettrica attraverso i canali. Questa valutazione quantitativa del flusso ionico a potenziali di membrana differenti hanno rivelato le proprietà molecolari di questi canali, come loro permeazione iono-selettivi e gating funzioni^1,2. La piattaforma di membrana per studi funzionali dei canali ionici è la membrana delle cellule o la membrana lipidica a doppio strato. Storicamente, monocanale elettriche corrente registrazioni vennero eseguiti per la prima volta nel bilayer del lipido^3,4, e le relative tecniche sono state sviluppate per le membrane cellulari, ad esempio il metodo di patch-clamp (Figura 1A )^5,6. Da allora, queste due tecniche si sono evolute separatamente per scopi diversi (Figura 1)^7,8.

I lipidi della membrana e membrane doppio strato sono attualmente al centro di ricerca per il loro ruolo nel sostenere la struttura e la funzione delle proteine canale. Pertanto, la disponibilità di metodi per variare la composizione lipidica in strati lipidici è in forte domanda. Metodi di formazione bilayer del lipido come il planare del lipido doppio strato (PLB)^8,9,10,11, gocciolina di acqua in olio doppio strato¹²e gocciolina interfaccia doppio strato (DIB)^{13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19} tecniche (Figura 1) sono scelte comuni, fornendo un’opportunità per esaminare la funzione di canale in variabili del lipido composizioni²⁰. Anche se il DIB è tecnicamente molto più facile da produrre rispetto il PLB convenzionale, le grandi dimensioni della DIB ha creato un disincentivo per patch-affrancate per applicarlo per studiare monocanale registrazioni corrente con usuali dimensioni conduttanza (< 100 pS).

Per aggirare il rumore di fondo, la zona di doppio strato deve essere minimizzata. Questo problema ricorda le ripetizioni di storia nello sviluppo di tecniche elettrofisiologiche per lipidici (Figura 1). Nei primi giorni, un doppio strato di piccole dimensioni (1-30 µm di diametro) è stato formato sulla punta di una pipetta (metodo punta-dip; Figura 1 C) ^{21 , 22 , 23}, anziché utilizzare un bilayer autoportante (~ 100 µm di diametro) su un setto idrofobo in una camera (Figura 1B). Il metodo di punta-dip ammessi per misure elettriche con molto più basso di rumore di sfondo²⁴. Le nostre esperienze con il PLB^25,26, punta-tuffo^22,23,27e patch-clamp^{28,29,30, 31} metodi ci ha portato a una nuova idea di formare lipidici utilizzando i principi del bilayer acqua in olio. Noi abbiamo fatto riferimento a questo come il contatto bolla doppio strato (CBB) metodo^20,32. In questo metodo, piuttosto che appendere le goccioline d’acqua in una fase di olio (Figura 1D), una bolla di acqua è saltata da una pipetta di vetro (con diametro di punta di circa 30 µm) nella fase oleosa (Figura 1E e 2), dove il bolla è mantenuta applicando una pressione costante. Forma un monostrato spontaneamente all’interfaccia acqua-olio sulla superficie della bolla. Quindi, due bolle sono ancorate attraverso la manipolazione di due pipette in vetro e il bilayer è formato come i due strati monomolecolari si avvicinano, producendo un’area di doppio strato di equilibrio. La dimensione della bolla è controllata la pressione intra-bolla (tenendo la pressione), e allo stesso modo la dimensione di doppio strato. Diametro medio di 50 µm è usato frequentemente. Anche se il volume della bolla è piccolo (< 100 pL), è collegato al più grande volume della soluzione pipetta che è nella gamma microlitro, che costituisce la fase di massa dell'elettrolito.

Ci sono molti vantaggi di utilizzare il metodo CBB (tabella 1). Come una tecnica di formazione del doppio strato lipidico, membrane di varie composizioni lipidiche possono essere prodotte e membrane asimmetriche sono più facilmente formato³² rispetto sono quelli tramite il metodo pieghevole convenzionale³³. Il doppio strato possa essere manipolato meccanicamente, a differenza del PLB convenzionale che può solo essere piegato con una differenza di pressione idrostatica^34,35. Modificando la pressione della holding, le bolle o espandere o ridurre, che conduce a membrana aumentata o diminuita tensione³². Il doppio strato è meccanicamente staccabile in strati monomolecolari, simili a di^36,di tecnica³⁷ freeze-frattura delle membrane in studi morfologici, ma con il gancio di traino, una manovra permette per ripetuti cicli³² di collegamento e scollegamento . Il piccolo volume della soluzione dell’elettrolito all’interno della bolla permette efficiente fusione dei liposomi ricostituiti canale in doppio strato, e la probabilità di ottenere registrazioni di canale è molto superiore con la tecnica convenzionale di PLB. Il volume di piccola bolla consente inoltre rapido aspersione (all’interno di ~ 20 ms) una volta un’altra iniezione pipetta viene inserito in una delle bolle. A differenza del metodo di patch-clamp, una volta rotto, una membrana CBB è ri-formata immediatamente e ripetutamente e pipette possono essere utilizzati più volte al giorno. Integrando i benefici del patch-clamp e metodi PLB, il gancio di traino fornisce una piattaforma versatile per variare le condizioni fisico-chimiche della membrana, permettendo senza precedenti studi di interazioni canale-membrana.

Prima di presentare un protocollo dettagliato del processo di formazione di CBB, background fisico-chimiche della formazione del doppio strato viene presentato il primo, che sarà utile per patch-affrancate risolvere difficoltà sperimentali relativi alla formazione della membrana che vengono rilevati.

Esperimenti CBB impartire lezioni di chimica di superficie scienza³⁸. Il gancio di traino è simile a una bolla di sapone soffiata da una cannuccia in aria, dove allo stesso modo, una bolla di acqua è soffiata in un solvente organico. Si noterà che una bolla d’acqua difficilmente viene gonfiata quando i lipidi della membrana non sono incluse nella bolla d’acqua o il solvente organico. In assenza di amphipathic lipidi, la tensione superficiale a un’interfaccia acqua-olio è elevata e la pressione intra-bolla per soffiare una bolla sarà alta. Si tratta di una realizzazione dell’equazione di Laplace (ΔP = 2 γ/R, dove ΔP è la pressione intra-bolla, γ è la tensione superficiale e R è il raggio della bolla). Quando la concentrazione dei lipidi in fase organica o la soluzione elettrolitica è elevata, aumenta la densità dei lipidi nello strato monomolecolare del, come dettato dalla isoterma di adsorbimento di Gibbs (-dγ = Γ_ho dµ_io, dove Γ è l’eccesso di superficie del composto i e µ_io è il potenziale chimico del componente i)³⁹, che conduce ad una bassa tensione superficiale e la facilità di formazione di bolle. Il gancio di traino, il doppio strato può essere osservato da un angolo tangenziale (Figura 2), nell’angolo di contatto tra il monostrato e doppio strato è misurabile. Questo angolo rappresenta un equilibrio tra il surface tensions del monostrato e doppio strato (equazione giovane: γ_bi = γ_mo cos(θ), dove γ_bi è il tensionamento di doppio strato, γ_mo è la tensione dello strato monomolecolare e θ è l’angolo di contatto). Le modifiche nell’angolo di contatto indicano cambiamenti nella tensione doppio strato, dato che la tensione di monostrato è valutata dalla variazione dell’angolo di contatto in funzione del potenziale di membrana (equazione di Young-Lippmann: γ_mo = C_m V² /4 (cos (θ₀) – cos (θ_v)), dove C_m è la capacità di membrana, V è il potenziale di membrana, e θ₀ e θ_v sono gli angoli di contatto a 0 e mV V, rispettivamente)^{40,41 ,42}. Quando due bolle sono abbastanza vicini, si avvicinano spontaneamente. Ciò è dovuto la forza di van der Waals, e possiamo osservare visivamente questo processo dinamico nella formazione di CBB.

Un sistema CBB è composto da fasi distinte: vale a dire, una fase di olio sfuso, acqua bolle rivestite con uno strato monomolecolare e un doppio strato di contatto (Figura 3). Queste sono le ricorda le fasi più osservate in un PLB, come un toro contenenti solventi intorno il doppio strato e una fase organica sottile intramezzato da due strati monomolecolari^43,44. Il gancio di traino, la fase di monostrato è in continuità con l’opuscolo di doppio strato, in molecole lipidiche prontamente diffondono tra il monostrato e il foglio illustrativo. La fase dello strato monomolecolare copre la maggior parte della superficie della bolla, che costituiscono la fase principale che funge da serbatoio del lipido. Perché la coda idrofobica dei lipidi nello strato monomolecolare del si estende verso l’esterno per la fase di olio sfuso, all’interno del doppio strato o il nucleo idrofobo viene aperta la fase di olio sfuso. Così, una sostanza idrofoba iniettata nella fase oleosa vicino a doppio strato è in grado di accedere facilmente all’interno del doppio strato. Questa è la tecnica di aspersione di membrana che avevamo sviluppato recentemente⁴⁵, di cui la composizione lipidica a doppio strato è cambiata rapidamente (entro un secondo) durante le registrazioni di corrente di singolo canale. Abbiamo trovato che il contenuto di colesterolo in doppio strato potrebbe essere controllato reversibilmente di accensione/spegnimento⁴⁵la perfusione di colesterolo. Nel caso in cui la concentrazione della sostanza in monostrato e doppio strato è diverso, il gradiente di concentrazione della sostanza in questione è dissolto immediatamente attraverso la diffusione, che è noto come l’ effetto Marangoni^{46, 47}. d’altra parte, infradito attraverso gli strati monomolecolari sono lento^48,49,50.

Utilizzando il metodo CBB, il doppio strato è formato in versatile condizioni fisico-chimiche, ad esempio un pH di elettrolito basso quanto 1 ⁵¹, una concentrazione di sale (K⁺, Na⁺, ecc.) fino a 3 M, un potenziale di membrana alto come mV ± 400 e un sistema temperatura fino a 60 ° c.

Ci sono diverse opzioni per la formazione del gancio di traino e l’incorporazione di molecole di canale in esso. Per la formazione di strato monomolecolare all’interfaccia acqua-olio, lipidi vengono aggiunti in un solvente organico (metodo del lipido-out; Figura 4 A, 4 C) o in una bolla come liposomi (metodo del lipido-in; Figura 4 B, 4D). In particolare, il metodo del lipido-in permette la formazione di membrane asimmetriche^15,32. Molecole di canale solubile in soluzione acquosa (ad es., formare canali peptidi) vengono aggiunti direttamente nella bolla (Figura 4A, B)^52,53, considerando che le proteine canale sono ricostituiti nell’ liposomi, che vengono quindi aggiunti nella bolla (Figura 4C, D). Nel presente documento, la formazione di CBB dal metodo del lipido-in per un peptide di canale (polytheonamide B (pTB); Figura 4 A) o una proteina (KcsA canale del potassio, Figura 4C) è indicata.

Protocol

1. preparare liposomi Disperdere i fosfolipidi (ad esempio, 10 mg in polvere) in cloroformio a una concentrazione desiderata (ad esempio, 10 mg/mL). Evaporare il cloroformio. Posto la soluzione del fosfolipide in un pallone e impostare su un evaporatore rotante (Vedi Tabella materiali) collegato a una bombola del gas2 N. Ruotare il pallone sotto flusso di2 N a temperatura ambiente fino a quando appare una pellicola sottile del fosfolipid…

Representative Results

Un tipico CBB aveva un diametro di 50 µm (Figura 56) e la capacità di membrana specifici in esadecano era 0,65 µF/cm2. La dimensione della bolla è stato arbitrariamente controllata dalla pressione intra-bolla. Quando piccole bolle sono necessari per le registrazioni di basso rumore, il diametro della punta deve essere corrispondentemente piccolo. Ad esempio, per una dimensione di bolla di 50 µm di diametro, il diametro della p…

Discussion

Il metodo CBB di formazione bilayer del lipido è basato sul principio di una gocciolina di acqua in olio allineata da un monostrato²⁰. Tecnicamente, le procedure per la formazione di CBB sono facili, soprattutto per i ricercatori di patch-clamp, che sono esperti nella manipolazione delle micropipette di vetro. L’installazione elettrofisiologica per il morsetto di toppa prontamente viene utilizzato il gancio di traino quando due manipolatori di pipetta con microinjectors sono disponibili. D’altra …

Materials

Azolectin (L-α-Phosphatidylcholine, Type IV-S)	Sigma-Aldrich	P3644
A/D Converter	Molecular Divices	Digidata1550A
Ag/AgCl electrode	Warner Instruments	64-1317
Bath Sonicator	Branson	M1800H-J
Camera	Hamamatsu Photonics	C11440-10C
Glass Capillary	Harvard Apparatus	30-0062
Hepes	Dojindo	342-01375
Hole Slideglass	Matsunami Glass	S339929
Inverted Microscope	Olympus	IX73
Isolation Table	Herz	TDI-86LA(Y)2
Micro Injenctor	Narishige	IM-11-2
Micro Manipulator	Narishige	EMM
Microforge	Narishige	MF-830
Micropipette holder
n-Hexadecane	Nacalai	07819-32
Patch-Clamp Amplifier	HEKA	EPC800
Pipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-87
POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine)	Avanti Polar Lipids	850457
POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine )	Avanti Polar Lipids	850757
POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) )	Avanti Polar Lipids	840457
Potassium Chloride	Nacalai	28514-75
Rotary Evapolator	Iwaki	REN-1000
Succinic Acid	Nacalai	32402-05
Vacuum Pump	Buchi	V-100