JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
신경과학

Lipid Bilayer eksperimenter med kontakt boble Bilayers for oppdateringen-Clampers

Published: January 16, 2019
doi:
10.3791/58840
,
1Department of Molecular Physiology and Biophysics,University of Fukui Faculty of Medical Sciences

Summary

Her presenterer vi en protokoll for dannelsen av lipid bilayers med en kontakt boble bilayer metode. En vann boble er blåst inn en organisk løsemiddel, der et monolayer er dannet på vann-olje grensesnittet. To Pipetter manipulert for å forankre bobler å danne en bilayer.

Abstract

Lipid bilayers gir en unik eksperimentelle plattform for funksjonell studier av ionekanaler, som tillater undersøkelse av kanal-membran interaksjoner under ulike membran lipid komposisjoner. Blant dem, har slippverktøy grensesnittet bilayer vunnet popularitet; men hindrer stort membran størrelsen innspillingen av lav elektrisk bakgrunnsstøy. Vi har etablert en kontakt boble bilayer (CBB) metode som kombinerer fordelene med planar lipid bilayer og patch-klemme metoder, for eksempel muligheten til å variere lipid sammensetningen og manipulere bilayer mekanikk, henholdsvis. Bruker oppsettet for konvensjonelle patch-klemme eksperimenter, kan CBB-baserte eksperimenter lett utføres. I korte trekk, en elektrolytt-løsning i en glass pipette er blåst inn i en organisk løsemiddel fase (hexadecane), og pipette trykket opprettholdes for å få en stabil boblestørrelse. Boblen er spontant foret med en lipid monolayer (ren lipider eller blandet lipider), som tilbys fra liposomer i bobler. Deretter forankres to monolayer-lined bobler (~ 50 µm i diameter) på spissen av glass Pipetter for bilayer-formasjonen. Innføring av kanal-rekonstituert liposomer i boblen fører til inkorporering av kanaler i bilayer, tillater én kanal stemmeopptaket med signal-til-støy forholdet sammenlignes med patch-klemme innspillinger. CBBs med en asymmetrisk lipid sammensetning dannes lett. CBB er fornyet gjentatte ganger av blåser ut tidligere bobler og danner nye. Ulike kjemiske og fysiske forstyrrelser (f.eks, membran perfusjon og bilayer spenning) kan bli pålagt CBBs. Herein, presenterer vi den grunnleggende prosedyren for CBB formasjon.

Introduction

Ionekanaler er cellemembranen ikke bare en støtte materiale, men en partner for å generere ion fluks. Funksjonelt, membranen er en elektrisk isolator i som ion kanaler er innebygd, og alle cellemembraner formidles med en hvile membran potensial. Konvensjonelt, ble en vilkårlig membran potensial innført fra en ekstern krets som elektrisk strøm gjennom kanaler ble målt. Dette kvantitativ vurdering av ion fluks på ulike membran potensialer avslørte molekylær egenskapene til disse kanalene, som deres ion-selektiv gjennomtrengning og gating funksjoner1,2. Membran plattformen for funksjonell studier av ionekanaler er cellen membran eller lipid bilayer membranen. Historisk enkanals elektrisk gjeldende innspillinger ble først fremført i lipid bilayers3,4, og relevante teknikker ble utviklet for celle membraner, som metoden patch-klemme (figur 1A )5,6. Siden da disse to teknikker har utviklet seg separat for ulike formål (figur 1)7,8.

Membran lipider og bilayer membraner er fokus for forskning for sine roller i å støtte struktur og funksjon av kanalen proteiner. Derfor er klar tilgjengeligheten av metoder å variere lipid sammensetningen i bilayers i høy etterspørsel. Lipid bilayer formasjon metoder som planar lipid bilayer (PLB)8,9,10,11, vann-i-olje dråpe bilayer12og slippverktøy grensesnittet bilayer (DIB)13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 teknikker (figur 1) er vanlig valg, gir en mulighet for å undersøke funksjonen kanalen under varierende lipid komposisjoner20. Tross av DIB er teknisk lettere å produsere enn den konvensjonelle PLB, den store størrelsen på DIB har skapt en disincentive for patch-clampers å bruke den for å studere enkanals gjeldende opptak med vanlig størrelse konduktans (< 100 hk).

For å omgå bakgrunnsstøy, minimeres bilayer området. Dette problemet minnes repetisjoner historie i utvikle elektrofysiologiske teknikker for lipid bilayers (figur 1). I begynnelsen, ble et lite bilayer (1-30 µm i diameter) dannet på spissen av en pipette (tips-dip-metoden. Figur 1 C) 21 , 22 , 23, snarere enn benytter en frittstående bilayer (~ 100 µm i diameter) på en hydrofobe septum i et kammer (figur 1B). Tips-dip metoden tillatt for elektriske målinger med mye lavere bakgrunn støy24. Våre erfaringer med PLB25,26, tips-dip22,23,27og patch-klemme28,29,30, 31 metoder ledet oss til en ny idé å danne lipid bilayers ved hjelp av prinsippene for vann-i-olje-bilayer. Vi har referert til dette som kontakt boble bilayer (CBB) metoden20,32. I denne metoden henger vanndråpene i en olje fase (figur 1D), en vann boble er blåst fra en glass pipette (med tuppens diameter på ca 30 µm) i olje fasen (figur 1E og 2), hvor den boble vedlikeholdes ved å bruke en jevn trykk. En monolayer former spontant på vann-olje grensesnittet på overflaten av boble. Deretter to bobler forankres gjennom manipulering av to glass Pipetter og bilayer er dannet som de to monolayers nærme hverandre, gir en likevekt bilayer området. Størrelsen på boblen styres av intra-boble trykket (holder press), og likeledes bilayer størrelsen. En gjennomsnittlig diameter på 50 µm brukes ofte. Selv om volumet av boblen er liten (< 100 pL), den er koblet til større volumet av pipette løsning i mikroliter området, utgjør elektrolytt bulklading.

Det er mange fordeler med å bruke metoden CBB (tabell 1). Som en lipid bilayer formasjon teknikk, membraner av ulike lipid komposisjoner kan produseres, og asymmetriske membraner er lettere dannet32 enn de av de konvensjonelle folding metode33. Bilayer kan være mekanisk manipulert, i motsetning til konvensjonelle PLB som kan bare være bøyd med en hydrostatisk trykk forskjellen34,35. Endrer holde trykket, bobler enten utvides eller krymper, fører til økt eller redusert membran spenning32. Bilayer er mekanisk avtakbar i monolayers, ligner på fryse-brudd teknikk36,37 av membraner i morfologiske studier, men med CBB, en manøver tillater for gjentatte koble fra og koble sykluser32 . Liten volumet av electrolyte løsning i boble kan effektiv blanding av kanal-rekonstituert liposomer i bilayer, og sannsynligheten for å få kanalen opptak er mye høyere enn med konvensjonelle PLB teknikken. Liten boble volumet kan også rask perfusjon (innen ~ 20 ms) når en annen injeksjon pipette settes inn i en av bobler. I motsetning til metoden patch-klemme når brutt, en CBB membran dannes re umiddelbart og gjentatte ganger, og Pipetter kan brukes flere ganger om dagen. Ved å integrere fordeler av oppdateringen-klemme og PLB metodene, gir CBB en allsidig plattform for å variere mekanisk-betingelsene av membranen, slik at for enestående studier av kanal-membran interaksjoner.

Før presentere detaljert protokollen CBB formasjon prosessen, er mekanisk-bakgrunn av bilayer dannelsen presentert første, som vil være nyttig for patch-clampers å løse eksperimentelle problemer knyttet til membran dannelse som er oppstått.

CBB eksperimenter formidle lærdom overflatekjemi vitenskap38. CBB ligner en såpeboble blåst fra et strå i luften, der likeledes en vann boble er blåst inn en organisk løsemiddel. En vil merke at en vann boble er neppe oppblåst når membran lipider ikke inkluderes i vann boble eller organisk løsemiddel. I fravær av amphipathic lipider, overflatespenning på en vann-olje-grensesnitt er høy og intra-boble presset til å blåse en boble vil være høy. Dette er en realisering av Laplace likning (ΔP = 2 γ/R, der ΔP er intra-boble trykket γ er overflatespenningen og R er radius boble). Når konsentrasjonen av lipider i organisk fasen eller elektrolytt-løsning er høy, tetthet av lipider i monolayer øker, så diktert av Gibbs adsorpsjon isotherm (-dγ = Γjeg dµjeg, hvor Γjeg er overflate overflødig sammensatte jeg, og µjeg er den kjemiske potensialet av komponenten jeg)39, fører til en lavere overflatespenning og brukervennlighet boble formasjon. CBB, bilayer kan observeres fra en tangentiell vinkel (figur 2) og kontakt vinkelen mellom monolayer og bilayer er målbare. Denne vinkelen representerer en likevekt mellom surface tensions av monolayer og bilayer (unge ligningen: γbi = γmo cos(θ), der den blebi er bilayer spenningen γmo er monolayer spenningen og θ er kontakt vinkelen). Endringene i kontakt vinkel angir endringer i bilayer spenningen, gitt at monolayer spenningen vurderes av endringer i kontakt vinkelen som en funksjon av membran potensial (Young-Lippmann ligningen: γmo = Cm V2 /4 (cos (θ0) – cos (θv)), der Cm er membran kapasitans, V er membran potensial og θ0 og θv er kontakt vinkler på 0 og V mV, henholdsvis)40,41 ,42. Når to bobler er nær nok, tilnærming de andre spontant. Dette skyldes van der Waals kraft, og vi kan visuelt observere denne dynamiske prosessen i CBB formasjonen.

En CBB system består av forskjellige faser: nemlig en bulk olje fasen, vann bobler belagt med en monolayer og en kontakte bilayer (Figur 3). Dette er minner om flere faser i en PLB, for eksempel en løsemiddel inneholder torus rundt bilayer fasen og en tynn organisk fase klemt av to monolayers43,44. CBB, monolayer fasen går bilayer brosjyren og lipid molekyler diffus lett mellom monolayer og heftet. Monolayer fasen dekker det meste av boble overflaten, utgjør den viktigste fasen som fungerer som en lipid-reservoaret. Fordi hydrofobe halen av lipider i monolayer strekker seg utover til olje bulklading, åpnes bilayer interiøret eller hydrofobe kjernen til olje bulklading. Dermed er en hydrofobe stoffet injiseres olje fasen nær bilayer lett tilgang bilayer interiøret. Dette er membran perfusjon teknikken vi hadde nylig utviklet45, som lipid sammensetningen i bilayer endres raskt (innen andre) under én kanal gjeldende innspillinger. Vi fant at kolesterol innholdet i bilayer reversibel kan kontrolleres ved å bytte kolesterol perfusjon og på45. Som konsentrasjonen av aktuelle stoffet i monolayer og bilayer er forskjellig, oppløses konsentrasjon gradient av aktuelle stoffet umiddelbart gjennom diffusjon, som er kjent som Marangoni effekt46, 47. derimot, flip-flops over monolayers er treg48,49,50.

Med metoden CBB bilayer er dannet under allsidig mekanisk-forhold, som en elektrolytt pH så lavt som 1 51, en salt (K+Na+, osv.) konsentrasjon til 3 M, en membran potensial så høyt som ±400 mV og et system temperaturen på opp til 60 ° C.

Det finnes flere alternativer for dannelsen av CBB og innlemmelse av kanalen molekyler deri. For dannelsen av monolayer på vann-olje grensesnittet legges lipider i en organisk løsemiddel (lipid-out-metoden. Figur 4 A, 4 C) eller boblediagrammer som liposomer (lipid-i metoden. Figur 4 B, 4 D). Spesielt tillater metoden lipid-i dannelse av asymmetrisk membraner15,32. Kanal molekyler løselig i vandig løsning (f.eks, kanal-forming peptider) legges direkte inn i boble (Figur 4A, B)52,53, mens kanalen proteiner er rekonstituert til liposomer, som legges deretter inn boble (Figur 4C, D). Her, dannelsen av CBBs av lipid-i metoden for enten en kanal peptid (polytheonamide B (pTB); Figur 4 A) eller et protein (KcsA kalium kanal, Figur 4C) vises.

Protocol

1. klargjør liposomer Spre fosfolipider (f.eks, 10 mg i pulver) i kloroform i en ønsket konsentrasjon (f.eks, 10 mg/mL). Fordampe kloroform. Sted phospholipid løsningen i en runde bunn kolbe og setter den på en roterende fordamperen (se Tabell for materiale) koblet til en N2 gass-sylinder. Rotere kolbe under N2 flyt ved romtemperatur til en tynn phospholipid film vises (etter ~ 30 min). Plass åpne flasken i en desiccator …

Representative Results

En typisk CBB hadde en diameter på 50 µm (figur 56) og bestemte membran kapasitans i hexadecane var 0,65 µF/cm2. Boblestørrelsen var tilfeldig kontrollert av intra-boble trykket. Når små bobler er nødvendig for støyfri opptak, skal tuppens diameter være tilsvarende liten. For eksempel for en boblestørrelse på 50 µm i diameter, bør tuppens diameter være 30 µm. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="…

Discussion

CBB metoden av lipid bilayer formasjon er basert på prinsippet om en vann-i-olje dråpe omgitt av en monolayer20. Teknisk, prosedyrene for å danne CBBs er enkel, spesielt for patch-klemme forskere, som er dyktige i å manipulere glass Mikropipetter. Elektrofysiologiske oppsettet for oppdateringen klemmen brukes lett CBB når to pipette manipulators med microinjectors er tilgjengelige. På den annen side, fordi CBB er en etterfølger av den konvensjonelle PLB, som mye mekanisk-kunnskap er akkumul…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne vil takke Mariko Yamatake og Masako Takashima for teknisk assistanse. Dette arbeidet var støttes delvis av KAKENHI gi nummer 16H 00759 og 17 H 04017 (SO).

Materials

Azolectin (L-α-Phosphatidylcholine, Type IV-S) Sigma-Aldrich P3644
A/D Converter Molecular Divices Digidata1550A
Ag/AgCl electrode Warner Instruments 64-1317
Bath Sonicator Branson M1800H-J
Camera Hamamatsu Photonics C11440-10C
Glass Capillary Harvard Apparatus 30-0062
Hepes Dojindo 342-01375
Hole Slideglass Matsunami Glass S339929
Inverted Microscope Olympus IX73
Isolation Table Herz TDI-86LA(Y)2
Micro Injenctor Narishige IM-11-2
Micro Manipulator Narishige EMM
Microforge Narishige MF-830
Micropipette holder
n-Hexadecane Nacalai 07819-32
Patch-Clamp Amplifier HEKA EPC800
Pipette Puller Sutter Instrument Co. P-87
POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) Avanti Polar Lipids 850457
POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
)		 Avanti Polar Lipids 850757
POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) ) Avanti Polar Lipids 840457
Potassium Chloride Nacalai 28514-75
Rotary Evapolator Iwaki REN-1000
Succinic Acid Nacalai 32402-05
Vacuum Pump Buchi V-100
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hille, B. . Ion channels of excitable membranes. , (2001).
  2. Oiki, S. Channel function reconstitution and re-animation: a single-channel strategy in the postcrystal age. The Journal of Physiology. 593, 2553-2573 (2015).
  3. Mueller, P., Rudin, D. O., Tien, H. T., Wescott, W. C. Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system. Nature. 194 (4832), 979-980 (1962).
  4. Hladky, S. B., Haydon, D. A. Discreteness of conductance change in bimolecular lipid membranes in the presence of certain antibiotics. Nature. 225, 451-453 (1970).
  5. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
  6. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
  7. Sakmann, B., Neher, E. . Single-Channel Recording. , (2009).
  8. Miller, C. . Ion Channel Reconstitution. , (1986).
  9. Wonderlin, W. F., Finkel, A., French, R. J. Optimizing planar lipid bilayer single-channel recordings for high resolution with rapid voltage steps. Biophysical journal. 58 (2), 289-297 (1990).
  10. Oiki, S., Okada, Y. Planar Lipid Bilayer Method for Studying Channel Molecules. Patch Clamp Techniques. , 229-275 (2012).
  11. Kapoor, R., Kim, J. H., Ingolfson, H., Andersen, O. S., O, Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments. Journal of Visualized Experiments. (20), e1033 (2008).
  12. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Lipid bilayer formation by contacting monolayers in a microfluidic device for membrane protein analysis. Analytical Chemistry. 78 (24), 8169-8174 (2006).
  13. Bayley, H., et al. Droplet interface bilayers. Molecular BioSystems. 4 (12), 1191-1208 (2008).
  14. Watanabe, R., Soga, N., Hara, M., Noji, H. Arrayed water-in-oil droplet bilayers for membrane transport analysis. Lab on a Chip. 16 (16), 3043-3048 (2016).
  15. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 130 (18), 5878-5879 (2008).
  16. Tonooka, T., Sato, K., Osaki, T., Kawano, R., Takeuchi, S. Lipid bilayers on a picoliter microdroplet array for rapid fluorescence detection of membrane transport. Small (Weinheim an der Bergstrasse, Germany). 10 (16), 3275-3282 (2014).
  17. Dixit, S. S., Kim, H., Vasilyev, A., Eid, A., Faris, G. W. Light-driven formation and rupture of droplet bilayers. Langmuir. 26 (9), 6193-6200 (2010).
  18. Malmstadt, N., Nash, M. a., Purnell, R. F., Schmidt, J. J. Automated formation of lipid-bilayer membranes in a microfluidic device. Nano letters. 6 (9), 1961-1965 (2006).
  19. Najem, J. S., et al. Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers. Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).
  20. Oiki, S., Iwamoto, M. Channel-Membrane Interplay in Lipid Bilayer Membranes Manipulated through Monolayer Technologies. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 41, 303-311 (2018).
  21. Andersen, O. S. Ion movement through gramicidin A channels. Single-channel measurements at very high potentials. Biophysical Journal. 41 (2), 119-133 (1983).
  22. Oiki, S., Danho, W., Madison, V., Montal, M. M2 delta, a candidate for the structure lining the ionic channel of the nicotinic cholinergic receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (22), 8703-8707 (1988).
  23. Oiki, S., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. Voltage-dependent gating of an asymmetric gramicidin channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (6), 2121-2125 (1995).
  24. Sigworth, F. J., Urry, D. W., Prasad, K. U. Open channel noise. III. High-resolution recordings show rapid current fluctuations in gramicidin A and four chemical analogues. Biophysical Journal. 52 (6), 1055-1064 (1987).
  25. Iwamoto, M., et al. Surface structure and its dynamic rearrangements of the KcsA potassium channel upon gating and tetrabutylammonium blocking. The Journal of Biological Chemistry. 281 (38), 28379-28386 (2006).
  26. Iwamoto, M., Oiki, S. Amphipathic antenna of an inward rectifier K+ channel responds to changes in the inner membrane leaflet. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (2), 749-754 (2013).
  27. Oiki, S., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. Asymmetric gramicidin channels: heterodimeric channels with a single F6Val1 residue. Biophysical Journal. 66 (6), 1823-1832 (1994).
  28. Ando, H., Kuno, M., Shimizu, H., Muramatsu, I., Oiki, S. Coupled K+-water flux through the HERG potassium channel measured by an osmotic pulse method. The Journal of General Physiology. 126 (5), 529-538 (2005).
  29. Kuno, M., et al. Temperature dependence of proton permeation through a voltage-gated proton channel. The Journal of General Physiology. 134 (3), 191-205 (2009).
  30. Iwamoto, M., Oiki, S. Counting Ion and Water Molecules in a Streaming File through the Open-Filter Structure of the K Channel. The Journal of Neuroscience. 31 (34), 12180-12188 (2011).
  31. Chang, H. K., Iwamoto, M., Oiki, S., Shieh, R. C. Mechanism for attenuated outward conductance induced by mutations in the cytoplasmic pore of Kir2.1 channels. Scientific Reports. 5, (2015).
  32. Iwamoto, M., Oiki, S. Contact Bubble Bilayers with Flush Drainage. Scientific Reports. 5, 9110 (2015).
  33. Montal, M., Mueller, P. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (12), 3561-3566 (1972).
  34. Petelska, A. D. Interfacial tension of bilayer lipid membranes. Central European Journal of Chemistry. 10 (1), 16-26 (2012).
  35. Benz, R., Conti, F. Effects of hydrostatic pressure on lipid bilayer membranes. I. Influence on membrane thickness and activation volumes of lipophilic ion transport. Biophysical Journal. 50 (1), 91-98 (1986).
  36. Meryman, H. T., Kafig, E. The study of frozen specimens, ice crystals and ice crystal growth by electron microscopy. Naval Medical Research Institute, National Naval Medical Center. , (1955).
  37. Steere, R. L. Electron microscopy of structural detail in frozen biological specimens. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 3 (1), 45-60 (1957).
  38. de Gennes, P. -. G., Brochard-Wyart, F., Quére, D. . Capillarity and Wetting Phenomena: Drops, Bubbles, Pearls, Waves. , (2003).
  39. Butt, H. -. J., Kappl, M. . Surface and Interfacial Forces. , (2018).
  40. Requena, J., Haydon, D. A. The Lippmann equation and the characterization of black lipid films. Journal of Colloid and Interface Science. 51 (2), 315-327 (1975).
  41. Taylor, G. J., et al. Direct in situ measurement of specific capacitance, monolayer tension, and bilayer tension in a droplet interface bilayer. Soft Matter. 11 (38), 7592-7605 (2015).
  42. Dixit, S. S., Pincus, A., Guo, B., Faris, G. W. Droplet shape analysis and permeability studies in droplet lipid bilayers. Langmuir. 28 (19), 7442-7451 (2012).
  43. White, S. H. Analysis of the torus surrounding planar lipid bilayer membranes. Biophysical Journal. 12 (4), 432-445 (1972).
  44. White, S. H., Miller, C. The physical nature of planar bilayer membranes. Ion Channel Reconstitution. , 3-35 (1986).
  45. Iwamoto, M., Oiki, S. Membrane Perfusion of Hydrophobic Substances Around Channels Embedded in the Contact Bubble Bilayer. Scientific Reports. 7 (1), 6857 (2017).
  46. Velarde, M. G., Zeytounian, R. K., et al. . Interfacial phenomena and the Marangoni effect. , (2002).
  47. Ryazantsev, Y. S., et al. Thermo- and soluto-capillarity: Passive and active drops. Advances in Colloid and Interface Science. 247, 52-80 (2017).
  48. Kornberg, R. D., Mcconnell, H. M. Inside-Outside Transitions of Phospholipids in Vesicle Membranes. 생화학. 10 (7), 1111-1120 (1971).
  49. Wimley, W. C., Thompson, T. E. Exchange and Flip-Flop of Dimyristoylphosphatidylcholine in Liquid-Crystalline, Gel, and Two-Component, Two-Phase Large Unilamellar Vesicles. 생화학. 29 (5), 1296-1303 (1990).
  50. Nakao, H., et al. pH-dependent promotion of phospholipid flip-flop by the KcsA potassium channel. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1848 (1), 145-150 (2015).
  51. Matsuki, Y., et al. Rectified Proton Grotthuss Conduction Across a Long Water-Wire in the Test Nanotube of the Polytheonamide B Channel. Journal of the American Chemical Society. 138 (12), 4168-4177 (2016).
  52. Iwamoto, M., Shimizu, H., Muramatsu, I., Oiki, S. A cytotoxic peptide from a marine sponge exhibits ion channel activity through vectorial-insertion into the membrane. FEBS letters. 584 (18), 3995-3999 (2010).
  53. Iwamoto, M., et al. Channel Formation and Membrane Deformation via Sterol-Aided Polymorphism of Amphidinol 3. Scientific Reports. 7 (1), 10782 (2017).
  54. Barry, P. H., Lynch, J. W. Liquid junction potentials and small cell effects in patch-clamp analysis. The Journal of Membrane Biology. 121 (2), 101-117 (1991).
  55. Barry, P. H. JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements. Journal of Neuroscience Methods. 51 (1), 107-116 (1994).
  56. Oiki, S., Muramatsu, I., Matsunaga, S., Fusetani, N. A channel-forming peptide toxin: polytheonamide from marine sponge (Theonella swinhoei). Nihon Yakurigaku Zasshi. 110, 195-198 (1997).
  57. Heginbotham, L., LeMasurier, M., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. Single streptomyces lividans K(+) channels: functional asymmetries and sidedness of proton activation. The Journal of General Physiology. 114 (4), 551-560 (1999).
  58. Cortes, D. M., Perozo, E. Structural dynamics of the Streptomyces lividans K+ channel (SKC1): oligomeric stoichiometry and stability. 생화학. 36 (33), 10343-10352 (1997).
  59. MacKinnon, R., Cohen, S. L., Kuo, A., Lee, A., Chait, B. T. Structural Conservation in Prokaryotic and Eukaryotic Potassium Channels. Science. 280 (5360), 106-109 (1998).
  60. LeMasurier, M., Heginbotham, L., Miller, C. KcsA: it’s a potassium channel. The Journal of General Physiology. 118 (3), 303-314 (2001).
  61. Iwamoto, M., Oiki, S. Constitutive boost of a K+ channel via inherent bilayer tension and a unique tension-dependent modality. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2018).
  62. Iwamoto, M., Elfaramawy, M. A., Yamatake, M., Matsuura, T., Oiki, S. Concurrent in Vitro Synthesis and Functional Detection of Nascent Activity of the KcsA Channel under a Membrane Potential. ACS Synthetic Biology. 7 (4), 1004-1011 (2018).
  63. Venkatesan, G. A., et al. Adsorption kinetics dictate monolayer self-assembly for both lipid-in and lipid-out approaches to droplet interface bilayer formation. Langmuir. 31 (47), 12883-12893 (2016).
  64. Silvius, J. R. Thermotropic phase transitions of pure lipids in model membranes and their modifications by membrane proteins. Lipid-protein Interactions. 2, 239-281 (1982).
  65. Lindsey, H., Petersen, N. O., Chan, S. I. Physicochemical characterization of 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine in model membrane systems. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 555 (1), 147-167 (1979).
  66. Moore, J. W., Hines, M., Harris, E. M. Compensation for resistance in series with excitable membranes. Biophysical Journal. 46 (4), 507-514 (1984).
  67. Armstrong, C. M., Chow, R. H. Supercharging: a method for improving patch-clamp performance. Biophysical Journal. 52 (1), 133-136 (1987).
  68. Armstrong, C. M., Gilly, W. F. Access resistance and space clamp problems associated with whole-cell patch clamping. Methods in Enzymology. 207, 100-122 (1992).
  69. Kojima, S., Iwamoto, M., Oiki, S., Tochigi, S., Takahashi, H. Thylakoid membranes contain a non-selective channel permeable to small organic molecules. Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7777-7785 (2018).
  70. Winterstein, L. M., et al. Reconstitution and functional characterization of ion channels from nanodiscs in lipid bilayers. Journal of General Physiology. 150 (4), 637-646 (2018).

Tags

Lipid BilayerContact Bubble BilayerPatch-clampingPlanar Lipid BilayerMembrane VibrationSingle Channel CurrentPhospholipid SuspensionProteoliposomesIon Channel ProteinsGlass PipettesMicro ForgeSiliconizing ReagentInverted Microscope
check_url/kr/58840?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Iwamoto, M., Oiki, S. Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers. J. Vis. Exp. (143), e58840, doi:10.3791/58840 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image