Vi præsenterer her, en protokol for dannelsen af lipid dobbeltlag ved hjælp af en kontakt boble tolagede metode. En vand boble er blæst ind i et organisk opløsningsmiddel, hvorved en éncellelag dannes på grænsefladen vand-olie. To pipetter er manipuleret til at forankre boblerne til at danne en tolagede.
Lipid dobbeltlag giver en unik eksperimentelle platform for funktionelle studier af Ionkanaler, giver undersøgelsen af kanal-membran interaktioner under forskellige membran lipid kompositioner. Blandt dem, har droplet interface tolagede vundet popularitet; dog hindrer den store membran størrelse optagelsen af lav elektriske baggrundsstøj. Vi har etableret en kontakt boble tolagede (CBB) metode, der kombinerer fordelene ved planar lipid tolagede og patch-clamp metoder, såsom evnen til at variere lipid sammensætning og manipulere tolagede mekanik, henholdsvis. Ved hjælp af setup for konventionelle patch-clamp eksperimenter, kan CBB-baserede eksperimenter let udføres. Kort sagt, en elektrolyt opløsning i et glas pipette er blæst ind i et organisk opløsningsmiddel fase (hexadecane), og pipette trykket opretholdes til at opnå en stabil boblestørrelse. Boblen er spontant foret med et lipid éncellelag (ren lipider eller blandet lipider), som er leveret fra Liposomer i boblerne. Næste, de to éncellelag-foret bobler (~ 50 µm i diameter) på spidsen af glas pipetter er forankret til tolagede dannelse. Indførelsen af kanal-rekonstitueres Liposomer i boblen fører til inddragelsen af kanaler i tolagede, giver mulighed for single-channel nuværende optagelse med et signal / støj-forhold sammenlignes med patch-clamp optagelser. CBBs med en asymmetrisk lipid sammensætning der let dannes. CBB er fornyet gentagne gange af blæser ud de foregående bobler og danner nye. Forskellige kemiske og fysiske forstyrrelser (fx, membran perfusion og tolagede spænding) kan pålægges CBBs. Herein, præsenterer vi den grundlæggende procedure for CBB dannelse.
For Ionkanaler er cellemembranen ikke blot en understøttende materiale, men en partner til at generere ion flux. Funktionelt, membranen er en elektrisk isolator som ion kanaler er integreret, og alle cellemembraner er formidles med en hvilende membran potentiale. Konventionelt, blev en vilkårlig membran potentiale indført fra et eksternt kredsløb som elektrisk strøm gennem kanalerne blev målt. Denne kvantitative evaluering af ion flux på forskellige membran potentialer afslørede de molekylære egenskaber af disse kanaler, såsom deres ion-selektiv gennemtrængning og gating funktioner1,2. Membran-platform for funktionelle studier af Ionkanaler er enten cellemembranen eller lipid tolagede membran. Historisk, enkanalet elektriske aktuelle optagelser blev uropført i lipid dobbeltlag3,4, og de relevante teknikker blev udviklet for cellemembraner, som metoden patch-klemme (figur 1A )5,6. Siden da har disse to teknikker har udviklet sig separat til forskellige formål (figur 1)7,8.
Membran lipider og tolagede membraner er i øjeblikket genstand for forskning for deres roller i støtte struktur og funktion af proteiner, kanal. Derfor er klar tilgængeligheden af metoder til at variere lipid sammensætning i dobbeltlag i høj efterspørgsel. Lipid tolagede dannelse metoder såsom planar lipid tolagede (PLB)8,9,10,11, vand-i-olie droplet tolagede12og slipværktøj interface tolagede (DIB)13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 teknikker (figur 1) er fælles valg, give mulighed for at undersøge funktionen kanal under varierende lipid kompositioner20. Selv om DIB er teknisk meget lettere at producere end de konventionelle PLB, den store størrelse af DIB’EN har skabt en hæmsko for patch-clampers til at anvende det til at studere enkanalet aktuelle optagelser med sædvanlige mellemstore ledningsevne (< 100 pS).
For at omgå baggrundsstøjen, skal området tolagede minimeres. Denne sag minder om gentagelser af historie i udvikle elektrofysiologiske teknikker for lipid dobbeltlag (figur 1). I de tidlige dage, blev en små tolagede (1-30 µm i diameter) dannet på spidsen af en pipette (tip-dip metode; Figur 1 C) 21 , 22 , 23, fremfor at bruge et fritstående tolagede (~ 100 µm i diameter) på en hydrofobe septum i et kammer (figur 1B). Tip-dip metode tilladt for elektriske målinger med meget lavere baggrund støj24. Vores erfaringer med PLB-25,26, tip-dip22,23,27og patch-clamp28,29,30, 31 metoder førte os til en roman idé med at danne lipid dobbeltlag ved hjælp af principperne om vand i olie tolagede. Vi har nævnt dette som kontakt boble tolagede (CBB) metode20,32. I denne metode, i stedet for at hænge vanddråber i en olie fase (fig. 1D), en vand boble er sprunget fra et glas pipette (med tip diameter af ca. 30 µm) ind i olie fase (figur 1E og 2), hvor den boble bevares ved at anvende en konstant pres. En éncellelag former spontant på grænsefladen vand-olie på overfladen af boble. Derefter to bobler er forankret gennem manipulation af to glas pipetter, og tolagede er dannet da de to encellelag nærmer sig hinanden, giver en ligevægt tolagede område. Størrelsen af boblen er kontrolleret af de intra-boble pres (holding pres), og ligeledes tolagede størrelse. En gennemsnitlig diameter på 50 µm bruges ofte. Selv om mængden af boblen er lille (< 100 pL), den er forbundet til den større mængde af den pipette løsning, der er i området microliter, der udgør hovedparten elektrolyt fase.
Der er mange fordele ved at bruge metoden CBB (tabel 1). Som en lipid tolagede dannelse teknik, membraner i forskellige lipid kompositioner kan produceres og asymmetriske membraner er mere let dannede32 end er dem af de konventionelle folde metode33. Tolagede kan manipuleres mekanisk, i modsætning til de konventionelle PLB, der kun kan være bøjet med en hydrostatisk tryk forskel34,35. Ved at ændre bedrift pres, boblerne enten udvide eller formindske, fører til øget eller nedsat membran spænding32. Tolagede er mekanisk aftagelig i encellelag, svarende til fryse-fraktur teknik36,37 af membraner i morfologiske undersøgelser, men med CBB, en manøvre giver mulighed for gentagne løsrive og vedhæfte cyklusser32 . Den lille mængde af elektrolytten løsning inden boblen giver mulighed for effektiv fusion af kanal-rekonstitueres Liposomer til tolagede, og sandsynligheden for at få kanal optagelser er meget højere end med de konventionelle PLB teknik. Lille boble volumen tillader også hurtig perfusion (inden for ~ 20 ms) en gang en anden injektion pipette er indsat i enten af boblerne. I modsætning til metoden patch-klemme når brudt, en CBB membran er re-formes straks og gentagne gange og pipetter kan bruges flere gange om dagen. Ved at integrere fordelene patch-clamp og PLB metoder, giver CBB en alsidig platform for at variere de fysisk-kemiske betingelser af membran, giver mulighed for hidtil uset undersøgelser af kanal-membran interaktioner.
Forelægge en detaljeret protokol af CBB dannelsen processen, er fysisk-kemiske baggrunden af tolagede dannelsen præsenteret første, som vil være nyttige for patch-clampers at løse eksperimentelle problemer vedrørende membran dannelse der er stødt på.
CBB eksperimenter give lektioner af overfladekemi videnskab38. CBB ligner en sæbeboble, blæst fra en halm i luften, hvor ligeledes en vand boble er blæst ind i et organisk opløsningsmiddel. Man vil bemærke, at en vand boble næppe er oppustet når membran lipider ikke er inkluderet i vand boblen eller den organisk opløsningsmiddel. I mangel af amphipathic lipider, overfladespænding på en vand-olie interface er høj, og intra-boble presset til at blæse en boble vil være høj. Dette er en erkendelse af Laplace ligning (Δp = 2 γ/R, hvor Δp er intra-boble pres, γ er overfladespænding, og R er boble radius). Når koncentrationen af lipider i enten den organiske fase eller elektrolyt opløsning er høj, tætheden af lipider i éncellelag stiger, da dikteres af Gibbs adsorption isoterm (-dγ = Γjeg dµjeg, hvor Γ,jeg er den overflade overskydende af sammensatte jeg, og µ,jeg er den kemiske potentiale af komponent jeg)39, fører til en lavere overfladespænding og lethed af boble dannelse. I CBB, tolagede kan ses fra en tangential vinkel (figur 2), og kontakt vinklen mellem éncellelag og tolagede er målelige. Denne vinkel repræsenterer en ligevægt mellem surface tensions af éncellelag og tolagede (unge ligning: γbi = γmo cos(θ), hvor γbi er tolagede spændinger, γmo er éncellelag spænding og θ er den kontakte vinkel). Ændringer i den kontaktperson vinkel angiver ændringer i tolagede spænding, da der éncellelag spændinger er vurderes ud fra ændringer i den kontaktperson vinkel som en funktion af membran potentiale (Young-Lippmann ligning: γmo = Cm V2 /4 (cos (θ0) – cos (θv)), hvor Cm er membran kapacitans, V er membran potentiale, og θ0 og θv er de kontakt vinkler på 0 og V mV, henholdsvis)40,41 ,42. Når to bobler er tæt nok, nærmer de hinanden spontant. Dette er på grund af van der Waals kraft, og vi kan visuelt observere denne dynamiske proces i CBB dannelse.
Et CBB system består af særskilte faser: nemlig en bulk olie fase, vand bobler belagt med en éncellelag og en kontakte tolagede (figur 3). Disse er minder om flere faser observeret i en PLB, såsom en opløsningsmiddel-holdige torus omkring den tolagede og en tynd organiske fase klemt af to encellelag43,44. I CBB, éncellelag fasen er løbende med tolagede folder og lipid molekyler diffuse let mellem éncellelag og indlægssedlen. Éncellelag fasen dækker det meste af den boble overflade, der udgør den store fase, der fungerer som et lipid reservoir. Fordi den hydrofobe hale af lipider i éncellelag udvider udad til bulk olie fase, åbner kraterets tolagede eller den hydrofobe core til bulk olie fase. En hydrofobe stof sprøjtes ind i olie fase tæt på tolagede er således let adgang kraterets tolagede. Dette er den membran perfusion teknik vi havde udviklet for nylig45, hvorved lipid sammensætning i tolagede ændres hurtigt (inden for et sekund) under single-channel nuværende optagelser. Vi fandt, at kolesterol indhold i tolagede reversibelt kunne kontrolleres ved at skifte kolesterol perfusion og slukker45. I tilfælde af, at koncentrationen af det pågældende stof i éncellelag og tolagede adskiller sig, opløses koncentration graduering af det relevante stof straks gennem diffusion, der er kendt som Marangoni effekt46, 47. på den anden side flip-flops på tværs af encellelag er langsom48,49,50.
Ved hjælp af metoden CBB, tolagede dannes under alsidig fysisk-kemiske forhold, såsom en elektrolyt pH så lavt som 1 51, salt (K+, Na+, osv.) koncentration op til 3 M, en membran potentiale så højt som ±400 mV og et system temperatur på op til 60 ° C.
Der er flere muligheder for dannelsen af CBB og indarbejdelse af kanal molekyler deri. For dannelsen af éncellelag på grænsefladen vand-olie, er lipider tilføjet enten i et organisk opløsningsmiddel (lipid-out metode; Figur 4 A, 4 C) eller i en boble som Liposomer (lipid-i metode; Figur 4 B, 4 D). Navnlig, lipid-i metode giver mulighed for dannelse af asymmetriske membraner15,32. Kanal molekyler opløseligt i vandig opløsning (fx, kanal-dannende peptider) tilføjes direkte ind i den boble (figur 4A, B)52,53, hvorimod kanal proteiner er fremstillet i Liposomer, der tilføjes derefter ind i boblen (figur 4C, D). Heri, dannelsen af CBBs af lipid-i-metoden til enten en kanal peptid (polytheonamide B (pTB); Figur 4 A) eller et protein (KcsA kalium kanal, figur 4C) er vist.
Metoden CBB af lipid tolagede dannelse er baseret på princippet om en vand-i-olie droplet foret af en éncellelag20. Teknisk, procedurer for at danne CBBs er let, især for patch-clamp forskere, der er dygtige i manipulere glas Mikropipetter. Den elektrofysiologiske setup nemlig den lappe klemme bruges let i CBB, når to pipette manipulatorer med microinjectors er tilgængelige. På den anden side fordi CBB er en efterfølger til den konventionelle PLB, for hvilke en stor mængde af fysisk-kemisk…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Mariko Yamatake og Masako Takashima for teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet i en del af KAKENHI grant numre 16H 00759 og 17 H 04017 (så).
Azolectin (L-α-Phosphatidylcholine, Type IV-S) | Sigma-Aldrich | P3644 | |
A/D Converter | Molecular Divices | Digidata1550A | |
Ag/AgCl electrode | Warner Instruments | 64-1317 | |
Bath Sonicator | Branson | M1800H-J | |
Camera | Hamamatsu Photonics | C11440-10C | |
Glass Capillary | Harvard Apparatus | 30-0062 | |
Hepes | Dojindo | 342-01375 | |
Hole Slideglass | Matsunami Glass | S339929 | |
Inverted Microscope | Olympus | IX73 | |
Isolation Table | Herz | TDI-86LA(Y)2 | |
Micro Injenctor | Narishige | IM-11-2 | |
Micro Manipulator | Narishige | EMM | |
Microforge | Narishige | MF-830 | |
Micropipette holder | |||
n-Hexadecane | Nacalai | 07819-32 | |
Patch-Clamp Amplifier | HEKA | EPC800 | |
Pipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-87 | |
POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) | Avanti Polar Lipids | 850457 | |
POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine ) |
Avanti Polar Lipids | 850757 | |
POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) ) | Avanti Polar Lipids | 840457 | |
Potassium Chloride | Nacalai | 28514-75 | |
Rotary Evapolator | Iwaki | REN-1000 | |
Succinic Acid | Nacalai | 32402-05 | |
Vacuum Pump | Buchi | V-100 |