Determinazione dei sottoinsiemi di regolamentazione delle cellule T nel timo murino, pancreatico drenante linfonodi e milza mediante citometria a flusso
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per preparare singole cellule da timo murino, pancreatico drenante linfonodi e milza per studiare ulteriormente queste cellule mediante citometria a flusso. Inoltre, questo protocollo è stato utilizzato per determinare le sottopopolazioni di cellule T regolatorie mediante citometria a flusso.
Abstract
Il nostro sistema immunitario è costituito da un numero e una varietà di cellule immuni compreso le cellule T regolatorie (Treg) di cellule. Le cellule Treg possono essere diviso in due sottoinsiemi, cellule Treg (tTreg) derivate timiche e marginalmente indotto le cellule Treg (pTreg). Sono presenti in diversi organi del nostro corpo e possono essere distinti dagli indicatori specifici, quali Helios e Neuropiline 1. È stato segnalato che le cellule tTreg sono funzionalmente più soppressive rispetto alle cellule pTreg. Pertanto, è importante determinare la proporzione di cellule tTreg e pTreg durante l’analisi di popolazioni eterogenee delle cellule. Nel presente documento, abbiamo raccolto ghiandole del timo, linfonodi drenanti pancreatici e milze dai topi diabetici non obesi normoglicemici di distinguere le cellule di tTreg dalle cellule pTreg mediante citometria a flusso. Abbiamo preparato manualmente sospensioni di cellule singole da questi organi. Fluorocromo coniugato superficie CD4, CD8, CD25 e Neuropiline 1 anticorpi sono stati utilizzati per colorare le cellule. Erano tenute in frigorifero durante la notte. Il giorno successivo, le cellule sono state macchiate con fluorocromo coniugato anticorpi intracellulari di Foxp3 e Helios. Questi indicatori sono stati usati per caratterizzare i due sottoinsiemi di cellule Treg. Questo protocollo viene illustrato un modo semplice ma pratico per preparare singole cellule da timo murino, pancreatico drenante linfonodi e milza e utilizzarli per l’analisi citofluorimetrica.
Introduction
Cellule regolarici di T (Treg) sono critiche per l’omeostasi del sistema immunitario. Le cellule Treg sono definite dall’espressione di antigeni di superficie CD4 e CD25 e la trascrizione fattore forkhead box P3 (Foxp3)1,2,3. Sakaguchi et al. in primo luogo ha mostrato che CD25 è costitutivamente espresso sulle cellule del soppressore di T in topi4, che ha fornito un’osservazione pionieristica per l’identificazione di cellule Treg umane. Le cellule Treg svolgono un ruolo centrale nella tolleranza immunitaria esercitando una soppressiva capacità attraverso una varietà di meccanismi, tra cui citolisi attraverso la secrezione di granzimi per indurre apoptosi, consumo di citochina e inibizione attraverso l’espressione di citotossici T-linfociti antigene 45. Inoltre, essi possono secernere citochine inibitorie come trasformazione di fattore di crescita beta (TGF-β), interleukin-10 (IL-10) e IL-355. Le cellule Treg naturalmente possono essere derivate dal timo, nel qual caso sono designati timica derivate cellule Treg (tTreg), o può essere indotta negli organi periferici, nel cui caso sono chiamati marginalmente indotto le cellule Treg (pTreg).
Helios, un membro della famiglia di fattore di trascrizione Ikaros, è stato segnalato per essere un indicatore per la distinzione tra cellule tTreg e cellule pTreg6. Più tardi, altri due gruppi ha riferito che Neuropiline 1 (Nrp1), un recettore III semaforine, potrebbe servire come un indicatore della superficie per le cellule di tTreg sotto certe condizioni7,8. Tuttavia, Singh et al hanno dimostrato che l’Helios è un migliore indicatore in questo contesto ingenuo topi9.
I sottoinsiemi di cellule Treg giocano un ruolo fondamentale nel mantenimento dell’omeostasi del sistema immunitario e nella protezione contro l’autoimmunità e infezione. Pertanto, è importante determinare i numeri e le proporzioni di queste popolazioni nei tessuti non linfoidi e linfoidi. Per raggiungere questo obiettivo, bisogna preparare sospensioni singola cella da questi organi. Diversi protocolli sono stati descritti o utilizzato negli studi precedenti. Principalmente, Dissociatori automatici sono stati utilizzati in rapporti precedentemente pubblicati10,11. Utilizzo automatici Dissociatori è conveniente e risparmio di tempo, ma è una procedura costosa. Di conseguenza, abbiamo utilizzato un metodo manuale per preparare sospensioni di cellule singole da murini ghiandole del timo, linfonodi drenanti del pancreas (PDLNs) e milze di topi diabetici non obesi (NOD) di normoglycemic e cellule singole isolate da questi organi. Questo metodo è stato utilizzato nei nostri studi precedenti e abbiamo trovato che il metodo manuale per la preparazione di sospensione unicellulare è efficiente come dissociatore automatico metodo9,12,13,14. Inoltre, abbiamo utilizzato la citometria a flusso per determinare le proporzioni di CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg le cellule e i sottoinsiemi di Treg cells in tTreg e pTreg. Le cellule tTreg e pTreg sono stati distinti con Helios e Nrp1 come marcatori per tTreg cella. Quindi, i nostri risultati indicano che il metodo manuale per la preparazione di singole cellule funziona in modo efficiente e le sospensioni preparate singola cella possono essere ulteriormente utilizzate per gli studi mediante citometria a flusso.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo studio, abbiamo isolato cellule singole ghiandole del timo, PDLNs e milze di topi NOD e studiato l’espressione di Helios e Nrp1 in CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg cellule mediante citometria a flusso. Nel presente studio, sono stati utilizzati topi NOD, che è un modello murino di diabete di tipo 1. In uno studio precedente, abbiamo utilizzato il CD-1 diversi ceppi di topi wild-type e topi C57BL/6 di indagare se Helios o Nrp1 è un migliore indicatore per distinguere le ce…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il presente studio è stato sostenuto finanziariamente dal Consiglio svedese della ricerca, EXODIAB, la Fondazione svedese per il diabete, fondo di diabete bambino svedese, SEB Diabetesfonden e O.E. och Edla Johanssons vetenskapliga stiftelse. Autori vorrebbero anche grazie Per-Ola Carlsson e Stellan Sandler per loro supporti e discussioni.
Materials
| NOD mice | In-house breading | ||
| HBSS | Statens veterinärmedicinska anstalt | 991750 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R0883-500ML | |
| NH4Cl | EMD Millipore | 1011450500 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10X) |
| eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer | ThermoFisher | 00-4222-26 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience | ThermoFisher | 11-0042-85 | |
| CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience | ThermoFisher | 12-0251-83 | |
| BD Pharmingen APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 560182 | |
| Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody | R&D Systems | FAB5994A | |
| FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience | ThermoFisher | 25-5773-82 | |
| Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody | BioLegend | 137220 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | CORNING | 352235 | A 35 µm nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap |
| Tube 15ml, 120x17mm, PP | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Micro tube 1.5ml | Sarstedt | 72.690.001 | |
| disposable scintillation vials | WHEATON | ||
| Flow cytometry | BD | ||
| Flow cytometry analysis software | Inivai Technologies | Flowlogic |
References
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