Détermination des sous-ensembles de lymphocytes T régulateurs dans le Thymus murin, pancréatique, drainage des ganglions lymphatiques et la rate à l’aide de cytométrie en flux
Summary
Ici, nous présentons un protocole visant à préparer les cellules individuelles de thymus murin, pancréatique, drainage des ganglions lymphatiques et la rate afin d’étudier ces cellules à l’aide de cytométrie en flux. En outre, ce protocole a été utilisé pour la détermination des sous-ensembles de lymphocytes T régulateurs utilisant l’écoulement cytometry.
Abstract
Notre système immunitaire se compose d’un nombre et une variété de cellules immunitaires, dont les lymphocytes T régulateurs de cellules (Treg). Les cellules Treg peuvent être divisés en deux sous-ensembles, les cellules Treg (tTreg) dérivées du thymus et accessoirement induite par les cellules Treg (pTreg). Elles sont présentes dans les différents organes de notre corps et se distingués par des marqueurs spécifiques, tels que Hélios et Neuropiline 1. Il a été signalé que les cellules tTreg sont fonctionnellement plus répressive que les cellules pTreg. Par conséquent, il est important de déterminer la proportion des cellules tTreg et pTreg dans les enquêtes sur les populations de cellules hétérogènes. Ici, nous avons recueilli glandes du thymus, ganglions lymphatiques de drainage pancréatiques et rate de normoglycémiques souris diabétiques non obèses pour distinguer les cellules de tTreg de pTreg des cellules à l’aide de cytométrie en flux. Nous avons préparé manuellement des suspensions de cellules simples de ces organes. Fluorochrome conjuguées de surface CD4, CD8, CD25 et Neuropiline 1 anticorps ont été utilisés pour colorer les cellules. Ils étaient conservés dans le réfrigérateur pendant la nuit. Le lendemain, les cellules ont été colorées avec les anticorps de Foxp3 et Helios intracellulaires fluorochrome conjugué. Ces marqueurs ont été utilisées pour caractériser les deux sous-ensembles de cellules Treg. Ce protocole montre un moyen simple mais pratique pour préparer des cellules individuelles de thymus murin, drainage des ganglions lymphatiques et la rate pancréas et utilisez-les pour cytométrie ultérieures.
Introduction
Les lymphocytes T (Treg) régulateurs sont critiques pour l’homéostasie du système immunitaire. Les cellules Treg sont définies par l’expression des antigènes de surface CD4 et CD25 et le facteur de transcription forkhead boîte P3 (Foxp3)1,2,3. Tout d’abord, Sakaguchi et coll. ont montré que CD25 est constitutivement exprimé sur les cellules T suppresseur souris4, qui prévoit une observation pionnier pour l’identification des cellules Treg humaines. Les cellules Treg jouent un rôle central dans la tolérance immunitaire, en exerçant une capacité suppressive par l’intermédiaire de divers mécanismes, y compris une cytolyse par le biais de la sécrétion de granzymes pour induire l’apoptose, la consommation de cytokine et l’inhibition par le biais de l’expression des cytotoxiques Lymphocytes T antigène 45. En outre, ils peuvent sécréter des cytokines inhibitrices comme transformant le facteur de croissance bêta (TGF-β), interleukine-10 (IL-10) et IL-355. Les cellules Treg peuvent naturellement être dérivés du thymus, auquel cas ils sont désignés les cellules Treg (tTreg) dérivées du thymus, ou ils peuvent être induites dans les organes périphériques, dans ce cas sont appelés périphériquement induite par les cellules Treg (pTreg).
PTreg cellules6et Helios, un membre de la famille de facteur de transcription Ikaros, a été signalé comme un marqueur pour distinguer les cellules tTreg. Plus tard, deux autres groupes ont déclaré que Neuropiline 1 (Nrp1), un récepteur III sémaphorines, pourrait servir de marqueur de surface pour tTreg cellules sous certaines conditions,7,8. Néanmoins, Singh et coll. ont montré que les Helios est un meilleur marqueur dans ce contexte de souris naïves9.
Les sous-ensembles de cellules Treg jouent un rôle essentiel dans le maintien de l’homéostasie du système immunitaire et dans la protection contre l’auto-immunité et l’infection. Par conséquent, il est important de déterminer le nombre et la proportion de ces populations dans les tissus lymphoïdes et non lymphoïdes. Pour y parvenir, il faut préparer des suspensions de cellules simples de ces organes. Un certain nombre de protocoles ont été décrit ou utilisé dans des études antérieures. Principalement, dissociators automatiques ont été utilisées dans des rapports publiés antérieurement10,11. L’utilisation de dissociators automatiques est pratique et gain de temps, mais c’est une procédure coûteuse. Par conséquent, nous avons utilisé une méthode manuelle pour préparer des suspensions cellulaires unique des glandes du thymus murins, les ganglions lymphatiques de drainage pancréatiques (PDLNs) et les rates de normoglycémiques non-obèses diabétiques (NOD) souris et isolé des cellules individuelles de ces organes. Cette méthode a été utilisée dans nos études précédentes et nous avons trouvé que la méthode manuelle pour préparer la suspension cellulaire unique est aussi efficace que dissociator automatique méthode9,12,13,14. En outre, nous avons utilisé la cytométrie en flux pour déterminer les proportions de CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg cellules et les sous-ensembles de Treg cellules tTreg et pTreg. Les cellules tTreg et pTreg ont été distingués au moyen de Helios et Nrp1 comme marqueurs de cellule tTreg. Par conséquent, nos résultats indiquent que la méthode manuelle pour préparer les cellules individuelles ne fonctionne efficacement et les suspensions préparée seule cellule permet davantage d’études utilisant l’écoulement cytometry.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cette étude, nous avons isolé des cellules individuelles de glandes thymiques, des PDLNs et des rates de souris NOD et examiné l’expression d’Hélios et Nrp1 CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg cellules à l’aide de cytométrie en flux. Dans la présente étude, des souris NOD ont été utilisés, qui est un modèle murin de diabète de type 1. Dans une étude précédente, nous avons utilisé le type sauvage souches de souris CD-1 et les souris C57BL/6 pour étudier si He…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La présente étude a été soutenue financièrement par le Conseil de recherche suédois, EXODIAB, la fondation suédoise de diabète, le fonds suédois pour les diabète enfant, SEB Diabetesfonden et O.E. och Edla Johanssons vetenskapliga stiftelse. Auteurs aimeraient aussi Merci Per-Ola Carlsson et Stellan Sandler pour leurs supports et leurs discussions.
Materials
| NOD mice | In-house breading | ||
| HBSS | Statens veterinärmedicinska anstalt | 991750 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R0883-500ML | |
| NH4Cl | EMD Millipore | 1011450500 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10X) |
| eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer | ThermoFisher | 00-4222-26 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience | ThermoFisher | 11-0042-85 | |
| CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience | ThermoFisher | 12-0251-83 | |
| BD Pharmingen APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 560182 | |
| Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody | R&D Systems | FAB5994A | |
| FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience | ThermoFisher | 25-5773-82 | |
| Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody | BioLegend | 137220 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | CORNING | 352235 | A 35 µm nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap |
| Tube 15ml, 120x17mm, PP | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Micro tube 1.5ml | Sarstedt | 72.690.001 | |
| disposable scintillation vials | WHEATON | ||
| Flow cytometry | BD | ||
| Flow cytometry analysis software | Inivai Technologies | Flowlogic |
References
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