JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
신경과학

أوتوراديوجرافي كطريقة بسيطة وقوية للتصور وتوصيف الأهداف الدوائية

Published: March 12, 2019
doi:
10.3791/58879
, , ,
1Department of Drug Design and Pharmacology, Faculty of Health and Medical Sciences,University of Copenhagen, 2Neurobiology Research Unit and CIMBI,Copenhagen University Hospital, 3Department of Clinical Physiology, Nuclear Medicine & PET,Copenhagen University Hospital

Summary

يتم استخدام أسلوب أوتوراديوجرافي بشكل روتيني لدراسة ملزمة راديوليجاندس إلى أقسام الأنسجة لتحديد الأدوية النوعية أو الكمية.

Abstract

في المختبر autoradiography يهدف إلى تصور توزيع تشريحية من بروتين فائدة في الأنسجة من الحيوانات التجريبية، فضلا عن البشر. ويستند الأسلوب ملزمة محددة من راديوليجاند إلى هدفها البيولوجية. لذلك، أقسام الأنسجة المجمدة هي المحتضنة مع راديوليجاند الحل والربط إلى الهدف بعد ذلك مترجمة قبل الكشف عن تسوس المشعة، على سبيل المثال، باستخدام فيلم حساس أو فوسفور imaging لوحات. عرض أوتوراديوجرامس الرقمية الناتجة عن القرار المكانية الرائع، الذي يتيح للقياس الكمي والتعريب لربط راديوليجاند في هياكل تشريحية متميزة. وعلاوة على ذلك، يسمح التحديد الكمي لتوصيف الدوائية ليجند تقارب عن طريق الانفصال من الثوابت (كد)، الثوابت تثبيط (كأنا)، فضلا عن كثافة مواقع الربط (بكحد أقصى) في الأنسجة المحددة. وهكذا، الأسلوب يوفر معلومات حول هدف التعريب ويجند الانتقائية. هنا، يتمثل الأسلوب مع الوصف أوتوراديوجرافيك من حمض عالية تقارب γ-هيدروكسيبيوتريك (GHB) مواقع في أنسجة المخ الثدييات، مع التركيز بوجه خاص على اعتبارات منهجية فيما يتعلق بمقايسة الربط الربط معلمات، الاختيار في راديوليجاند وطريقة الكشف.

Introduction

أوتوراديوجرافي الطريقة التي توفر صوراً اضمحلال الإشعاعي. يتم استخدام التقنية بشكل روتيني لدراسة توزيع الأنسجة من البروتين من الفائدة في المختبر يقوم على تفاعل معينة الدوائي بين مجمع راديولابيليد وهدفها. وهذا يوفر معلومات مباشرة حول الانتقائية ليجند للهدف. ويمكن أيضا استخدام أوتوراديوجرافي في المختبر لتحديد الكمية من معلمات الربط الدوائي من راديوليجاندس، مثل ثابت التفكك (كد) وكثافة من مواقع الربط (بكحد أقصى)، وكذلك لتحديد تثبيط الثابت (Ki)1،يغاندس المتنافسة2. بالمقارنة مع الربط راديوليجاند هوموجيناتي التقليدية، قد أوتوراديوجرافي بميزة القدرة على تصور التشريح المكانية وتفاصيل مقتضبة عن أنماط التعبير الإقليمي3. ولذلك طريقة autoradiography بديل ذات صلة إلى إيمونوسيتوتشيميستري، لا سيما في حالة عدم وجود جسم تم التحقق من صحتها. Autoradiography وينفذ بسهولة في مختبر النظائر المشعة قياسية نظراً لتوافر راديوليجاند مناسبة مع خصوصية الدوائية المطلوبة، الوصول إلى كريوستات مبضع إعداد أقسام الأنسجة، وتصوير مناسبة جهاز قادر على تحليل توزيع النشاط الإشعاعي في أقسام الأنسجة الخاصة بكل منها. جدير بالذكر أن معيار تحديد مهم راديوليجاند كمية محدودة من الربط بالمواقع غير المستهدفة. هذا يمكن أن يكون للبروتينات، الأغشية أو مواد مثل البلاستيك أو عوامل أخرى، وهو يشار إليها باسم الربط غير محددة. عادة، غير محددة ملزمة غير ستثربل لكن يمكن أن تكون ستثربل إذا كان ذلك ينطوي على بروتين خارج الهدف محدد. أفضل طريقة للتحقق من صحة ملزمة محددة الحقيقية مقارنة بالانسجة التي تفتقر إلى الهدف، مثلاً، وراثيا هندسة الأنسجة (المغلوب)4.

هنا، يوضح المنهجية مع وصف الموقع عالية تقارب ملزمة لحمض هيدروكسيبيوتريك γ (GHB) في الدماغ الثدييات أوتوراديوجرافيك. فهم التفاعل الدوائي بين GHB وموقعها ملزمة صلة GHB دواء سريرياً مفيدة في علاج الخدار وإدمان الكحول5، ولكن أيضا مكوناً طبيعية من الدماغ الثدييات وترفيهية 6من المخدرات. ووصفت مواقع الربط GHB عالية تقارب أولاً استخدام [ح]3[GHB ملزمة للفئران الدماغ هوموجيناتي7. على مر السنوات، مواصلة الدراسات أوتوراديوجرافي مع [ح]3[GHB والتماثلية [ح]3[قد أظهرت سي إس-382 بكثافة عالية لربط مواقع في مناطق فوريبرين من الفئران8،9،10،9 من الماوس ، خنزير الدماغ11والإنسان القرد12. ومع ذلك، ظلت هوية الجزيئية وأهميتها الفنية الدقيقة من مواقع الربط هذه بعيد المنال.

ووضعت مع نية لزيادة تمييز مواقع الربط، وتيسيرا لدراسات عن دور GHB الفسيولوجية، راديوليجاندس متعددة تتضمن نظائر مختلفة تتمتع بمختلف الانتماءات ([ح]3[GHB، [3 ح] سي إس-382، [ح]3[هوكبكا و [125أنا] بنوف-GHB)14،13،،من1516(استعرض في17) (الشكل 1). تركيبة انتقائية عالية تقارب راديوليجاندس وكثافة أنسجة عالية جداً لربط مواقع قد سمحت لإنتاج صور عالية الجودة باستخدام الفوسفور التصوير تقنية9،11. جنبا إلى جنب مع موجز للنقاط العملية في إعداد تجربة أوتوراديوجرافيك ومثالا لتجسيد التفاصيل، سيركز القسم مناقشة ط) اختيار النويدات المشعة، وثانيا) اختيار شروط المقايسة، والثالث) استخدام الفوسفور لوحات التصوير مقابل فيلم الأشعة السينية. والهدف العام من هذه الورقة تقديم التفاصيل التقنية والمنهجية والعلمية على تقنية أوتوراديوجرافي لإعلام حول توزيع الأنسجة وتحليل الأهداف البروتين الدوائي.

Protocol

وأجرى جميع الحيوانات التعامل مع امتثالا للمبادئ التوجيهية من “الحيوان الدنماركي التجريب المفتشية”. ملاحظة: بروتوكول وصف هنا تغطي إعداد الأنسجة (أيأنسجة المخ الماوس)، في المختبر أوتوراديوجرافيك المقايسة بتفصيل كاف لإعداد الأسلوب في مختبر جديد، والتعرض فوسفور imagin…

Representative Results

باستخدام بروتوكول وصف، كان تصور التشريحية توزيع مواقع الربط GHB عالية تقارب مع GHB التناظرية [ح]3[راديولابيليد هوكبكا في الدماغ الماوس، والتي قطعت إلى أقسام الاكليلية، السهمي والأفقية (الرقم 3 ). ولوحظت مستويات عالية من الربط في قرن آمون وقشرة، ملزمة أق…

Discussion

في أغلب الأحيان تتحدد نوعية الإنزيم أوتوراديوجرافيك حساسية راديوليجاند. عاملاً مساهما رئيسيا هو النظائر المشعة المحددة، التي تعطي بتوافر يغاندس المعروفة أو بجدوى تقنيات وضع العلامات المحددة للعائد يغاندس مع النشاط المحدد المناسب (أي، ومقدار النشاط الإشعاعي كل وحدة مول من راديوليج…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وكان دعم العمل مؤسسة Lundbeck (منحة R133-A12270) ومؤسسة نوفو نورديسك (منحة NNF0C0028664). يشكر المؤلفون الدكتور أليس ماريك لتوريد راديوليجاند [ح]3.

Materials

Absolute ethanol Merck Millipore 107017
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
BAS-TR2040 Imaging Plate GE Healthcare Life Science 28956481 20×40 cm – Sensitive to tritium
Cresyl violet acetate Sigma-Aldrich C5042-10G
DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy) Merck Millipore 100579
O.C.T. Compound, 12 x 125 mL Sakura 4583 Tissue-Tek
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 16005-1KG-R
Superfrost Plus slides VWR 631-9483 microscope slides
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set Sakura Finetek Denmark ApS 4451
Tritium Standard on Glas American Radiolabeld Chemicals, Inc. ART 0123
Xylene substitute Sigma-Aldrich A5597
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Upham, L. V., Englert, D. F. . Handbook of Radioactivity Analysis. , 1063-1127 (2003).
  2. Manuel, I., et al. Neurotransmitter receptor localization: From autoradiography to imaging mass spectrometry. ACS Chemical Neuroscience. 6, 362-373 (2015).
  3. Pavey, G. M., Copolov, D. L., Dean, B. High-resolution phosphor imaging: validation for use with human brain tissue sections to determine the affinity and density of radioligand binding. Journal of Neuroscience Methods. 116, 157-163 (2002).
  4. Davenport, A. P. . Receptor Binding Techniques. 897, (2012).
  5. Busardò, F. P., Kyriakou, C., Napoletano, S., Marinelli, E., Zaami, S. Clinical applications of sodium oxybate (GHB): from narcolepsy to alcohol withdrawal syndrome. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 19, 4654-4663 (2015).
  6. Wong, C. G. T., Gibson, K. M., Snead, O. C. I. From the street to the brain: neurobiology of the recreational drug γ-hydroxybutyric acid. Trends in Pharmacological Sciences. 25, 29-34 (2004).
  7. Benavides, J., et al. High affinity binding site for γ-hydroxybutyric acid in rat brain. Life Sciences. 30, 953-961 (1982).
  8. Hechler, V., Gobaille, S., Maitre, M. Selective distribution pattern of y-hydroxybutyrate receptors in the rat forebrain and midbrain as revealed by quantitative autoradiography. Brain Research. 572, 345-348 (1992).
  9. Klein, A. B., et al. Autoradiographic imaging and quantification of the high-affinity GHB binding sites in rodent brain using 3H-HOCPCA. Neurochemistry International. 100, 138-145 (2016).
  10. Gould, G. G., Mehta, A. K., Frazer, A., Ticku, M. K. Quantitative autoradiographic analysis of the new radioligand [3H](2E)-(5-hydroxy-5,7,8,9-tetrahydro-6H-benzo[α][7]annulen-6-ylidene) ethanoic acid ([3H]NCS-382) at γ-hydroxybutyric acid (GHB) binding sites in rat brain. Brain Research. 979, 51-56 (2003).
  11. Jensen, C. H., et al. Radiosynthesis and evaluation of [11C]3-hydroxycyclopent-1- enecarboxylic acid as potential PET ligand for the high-affinity γ-hydroxybutyric acid binding sites. ACS Chemical Neuroscience. , 22-27 (2017).
  12. Castelli, M. P., Mocci, I., Langlois, X., Gommeren, W., Luyten, W. H. M. L. Quantitative autoradiographic distribution of γ-hydroxybutyric acid binding sites in human and monkey brain. Molecular Brain Research. 78, 91-99 (2000).
  13. Wellendorph, P., et al. Novel radioiodinated γ-hydroxybutyric acid analogues for radiolabeling and photolinking of high-affinity γ-hydroxybutyric acid binding sites. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335, 458-464 (2010).
  14. Vogensen, S. B., et al. New synthesis and tritium labeling of a selective ligand for studying high-affinity γ-hydroxybutyrate (GHB) binding sites. Journal of Medicinal Chemistry. 56, 8201-8205 (2013).
  15. Mehta, A. K., Muschaweck, N. M., Maeda, D. Y., Coop, A., Ticku, M. K. Binding characteristics of the γ-hydroxybutyric acid receptor antagonist [3H](2E)-(5-hydroxy-5,7,8,9-tetrahydro-6H-benzo[a][7]annulen-6-ylidene) ethanoic acid in the rat brain. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 299, 1148-1153 (2001).
  16. Kaupmann, K., et al. Specific γ-hydroxybutyrate-binding sites but loss of pharmacological effects of γ-hydroxybutyrate in GABAB(1)-deficient mice. 신경과학. 18, 2722-2730 (2003).
  17. Bay, T., Eghorn, L. F., Klein, A. B., Wellendorph, P. GHB receptor targets in the CNS: Focus on high-affinity binding sites. Biochemical Pharmacology. 87, 220-228 (2014).
  18. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2008).
  19. Carletti, R., Tacconi, S., Mugnaini, M., Gerrard, P. Receptor distribution studies. Current Opinion in Pharmacology. 35, 94-100 (2017).
  20. Wellendorph, P., et al. Novel cyclic γ-hydroxybutyrate (GHB) analogs with high affinity and stereoselectivity of binding to GHB sites in rat brain. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 315, 346-351 (2005).
  21. Coenen, H. H., et al. Consensus nomenclature rules for radiopharmaceutical chemistry – Setting the record straight. Nuclear Medicine and Biologly. 55, (2017).
  22. DeBlasi, A., O’Reilly, K., Motulsky, H. J. Calculating receptor number from binding experiments using same compound as radioligand and competitor. Trends in Pharmacological Science. 10, 227-229 (1989).
  23. Hulme, E. C. . Receptor-ligand interactions: a practical approach. , (1992).
  24. Holm, P., et al. Plaque deposition dependent decrease in 5-HT2A serotonin receptor in AβPPswe/ PS1dE9 amyloid overexpressing mice. Journal of Alzheimer’s Disease. 20, 1201-1213 (2010).
  25. Thomsen, C., Helboe, L. Regional pattern of binding and c-Fos induction by (R)- and (S)-citalopram in rat brain. Neurochemistry. 14, 2411-2414 (2003).
  26. López-Giménez, J. F., Mengod, G., Alacios, J. M., Vilaró, M. T. Selective visualization of rat brain 5-HT2A receptors by autoradiography with [3H]MDL 100 ,907. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. , 446-454 (1997).
  27. Alexander, G. M., Schwartzman, R. J., Bell, R. D., Yu, J., Renthal, A. Quantitative measurement of local cerebral metabolic rate for glucose utilizing tritiated 2-deoxyglucose. Brain Research. 223, 59-67 (1981).
  28. Kuhar, M. J., Unnerstall, J. R. Quantitative receptor mapping by autoradiography: some current technical problems. Trends in Neurosciences. , 49-53 (1985).
  29. Kuhar, M. J., De Souza, E. B., Unnerstall, J. R. Neurotransmitter receptor mapping by autoradiography and other methods. Annual Review of Neuroscience. , 27-59 (1986).
  30. Chen, H. -. T., Clark, M., Goldman, D. Quantitative Autoradiography of 3H-Paroxetine Binding Sites in Rat Brain. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 27, 209-216 (1992).
  31. Herkenham, M., Pert, C. B. Light microscopic localization of brain opiate receptors: a general autoradiographic method which preserves tissue quality. Journal of Neuroscience. 2, 1129-1149 (1982).
  32. Heimer, L., Záborszky, L. . Neuroanatomical Tract-Tracing Methods 2 – Recent progress. , (1989).
  33. Vessotskie, J. M., Kung, M. P., Chumpradit, S., Kung, H. F. Quantitative autoradiographic studies of dopamine D3receptors in rat cerebellum using [125I]S(-)5-OH-PIPAT. Brain Research. 778, 89-98 (1997).
  34. Klein, A. B., et al. 5-HT2A and mGLU2receptor binding levels are related to differences in impulsive behavior in the roman low- (RLA) and high- (RHA) avoidance rat strains. 신경과학. , 36-45 (2014).
  35. Johnston, R. F., Pickett, S. C., Barker, D. L. Autoradiography using storage phosphor technology. Electrophoresis. 11, 355-360 (1990).
  36. Ito, T., Suzuki, T., Lim, D. K., Wellman, S. E., Ho, I. K. A novel quantitative receptor autoradiography and in situ hybridization histochemistry technique using storage phosphor screen imaging. Journal of Neuroscience Methods. 59, 265-271 (1995).
  37. Amemiya, Y., Miyahara, J. Imaging plate illuminates many fields. Nature. 336, 89-90 (1988).
  38. Kanekal, S., Sahai, A., Jones, R. E., Brown, D. Storage-phosphor autoradiography: a rapid and highly sensitive method for spatial imaging and quantitation of radioisotopes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. , 171-178 (1995).
  39. Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry – issues concerning methods , utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49, 411-424 (2011).
  40. Uhl, P., Fricker, G., Haberkorn, U., Mier, W. Radionuclides in drug development. Drug Discovery Today. 20, 198-208 (2015).
  41. Schmidt, K. C., Smith, C. B. Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: Implications for functional brain imaging in animal research. Nuclear Medicine and Biolology. 32, 719-725 (2005).
  42. Piel, M., Vernaleken, I., Rösch, F. Positron emission tomography in CNS drug discovery and drug monitoring. Journal of Medicinal Chemistry. 57, 9232-9258 (2014).
  43. Kristensen, J. L., Herth, M. M. In vivo imaging in drug discovery. Drug Design and Discovery. , 119-135 (2017).
  44. Cunha, L., Szigeti, K., Mathé, D., Metello, L. F. The role of molecular imaging in modern drug development. Drug Discovery Today. 19, 936-948 (2014).
  45. Bailly, C., et al. Comparison of Immuno-PET of CD138 and PET imaging with 64CuCl2and18F-FDG in a preclinical syngeneic model of multiple myeloma. Oncotarget. 9, 9061-9072 (2018).
  46. Sóvágó, J., Makkai, B., Gulyás, B., Hall, H. Autoradiographic mapping of dopamine-D2/D3receptor stimulated [35S]GTPγS binding in the human brain. European Journal of Neuroscience. 22, 65-71 (2005).
  47. Sóvágó, J., Dupuis, D. S., Gulyás, B., Hall, H. An overview on functional receptor autoradiography using [35S]GTPγS. Brain Research Reviews. 38, 149-164 (2001).
  48. Solon, E. G. Use of radioactive compounds and autoradiography to determine drug tissue distribution. Chemical Research in Toxicology. 25, 543-555 (2012).
  49. Donnelly, D. J. Small molecule PET tracers in drug discovery. Seminars in Nuclear Medicine. 47, 454-460 (2017).

Tags

AutoradiographyProtein BindingPharmacological TargetsCryostat SectioningRadioligand LabelingNon-specific BindingSpatial ResolutionDigital ImagingPharmacological Analysis
check_url/kr/58879?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Griem-Krey, N., Klein, A. B., Herth, M., Wellendorph, P. Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets. J. Vis. Exp. (145), e58879, doi:10.3791/58879 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image