Autoradiografi som en enkel och kraftfull metod för visualisering och karakterisering av farmakologiska mål

Summary

Metoden för autoradiografi används rutinmässigt för att studera bindning av radioligands till vävnadssnitt för bestämning av kvalitativa eller kvantitativa farmakologi.

Abstract

In vitro autoradiografi syftar till att visualisera anatomiska fördelningen av ett protein av intresse i vävnad från experimentella djur liksom människor. Metoden bygger på den specifika bindningen av en radioligand till sitt biologiska mål. Därför frysta vävnadssnitt inkuberas med radioligand lösning och bindningen till målet är därefter lokaliserade genom påvisande av radioaktivt sönderfall, exempelvis med hjälp av ljuskänsliga filmen eller fosfor imaging plattor. Resulterande digital autoradiograms Visa anmärkningsvärda rumsliga upplösningen, vilket möjliggör kvantifiering och lokalisering av radioligand bindning i skilda anatomiska strukturer. Dessutom tillåter kvantifiering för farmakologiska karakterisering av liganden affinitet med hjälp av dissociation konstanter (K_d), hämning konstanter (K_jag) samt tätheten av bindningsställen (B_max) i valda vävnader. Metoden ger alltså information om både målet lokalisering och ligand selektivitet. Här exemplifieras tekniken med den autoradiografiska karakterisering av hög affinitet γ-verkan syra (GHB) bindande platser i däggdjur hjärnvävnad, med särskild tonvikt på metodologiska överväganden angående bindande analysen parametrar, valet av radioligand och identifieringsmetoden.

Introduction

Autoradiografi är en metod som ger bilder av radioaktivt sönderfall. Tekniken används rutinmässigt för att studera vävnad fördelningen av ett protein med intresse i vitro som baserat på en specifik farmakologisk interaktion mellan en radioaktivt märkt substans och dess mål. Detta ger direkt information om selektivitet av liganden för målet. In vitro autoradiografi kan också användas för kvantitativ bestämning av farmakologiska bindande parametrar för radioligands, såsom dissociationskonstant (K_d) och täthet av bindningsställen (B_max), samt för att fastställa den hämning konstanten (K_i) konkurrerande ligander^1,2. Jämfört med traditionella Homogenatet radioligand bindande, har autoradiografi fördelen av att kunna visualisera rumsliga anatomi och ge kortfattad information om regionala uttryck mönster³. Metoden för autoradiografi är därför ett relevant alternativ till immuncytokemi, särskilt i avsaknad av en validerad antikropp. Autoradiografi genomförs enkelt i en standard radioisotop laboratorium ges tillgång till en lämplig radioligand med krävs farmakologisk specificitet, tillgång till en mikrotom kryostat för att förbereda vävnadssnitt och en lämplig imaging enhet som kan analysera fördelningen av radioaktivitet i avsnitten respektive vävnad. Noterbart är ett viktigt urvalskriterium för radioligand en begränsad mängd bindning till icke-målorganismer platser. Detta kan vara att andra proteiner, membran eller material som plast eller filter, och benämns kollektivt som icke-specifik bindning. Vanligtvis, icke-specifik bindning är ej mättnadsbar men kan vara mättnadsbar om det innebär ett särskilt protein som off-target. Det bästa sättet för att validera sant specifik bindning är att jämföra med vävnader saknar målet, t.ex., genetiskt modifierade (knock-out) vävnad⁴.

Här, illustreras metoden som med den autoradiografiska karakterisering av hög affinitet bindningsstället för γ-verkan syra (GHB) i däggdjur hjärnan. Förstå farmakologiska samspelet mellan GHB och dess bindningsställe är relevant eftersom GHB är både en kliniskt användbar drog i behandling av narkolepsi och alkoholism⁵, men också en naturlig beståndsdel i däggdjur hjärnan och ett fritids drog⁶. Hög affinitet GHB bindningsställen beskrevs först använda [³H] GHB bindning till råtta hjärnan Homogenatet⁷. Med åren ytterligare autoradiografi studier med [³H] GHB och analogt [³H] NCS-382 har visat en hög täthet av bindningsställen i framhjärnan regioner av råtta^8,9,10, mus⁹ , gris¹¹och apa/mänskliga hjärnan¹². Molekylär identitet och exakta funktionell betydelse av dessa bindande platser har dock förblivit svårfångad.

Med avsikten att ytterligare karakterisera de bindande platserna och för att underlätta studier om de fysiologiska roll GHB, flera radioligands införliva olika isotoper begåvad med olika tillhörighet har utvecklats ([³H] GHB, [³ H] NCS-382, [³H] HOCPCA och [¹²⁵jag] BnOPh-GHB)^13,14,15,16(ses i¹⁷) (figur 1). Kombinationen av selektiv hög affinitet radioligands och en mycket hög täthet av bindningen platser har tillåtit för produktion av högkvalitativa bilder med hjälp av den fosfor som imaging teknik^9,11. Tillsammans med en disposition av de praktiska punkterna att inrätta ett den autoradiografiska experiment och en illustration att exemplifiera detaljer, kommer att diskussionsavsnittet betona i) valet av radionuklid, ii) Val av assay villkor och iii) användningen av fosfor Imaging plattor kontra röntgenfilm. Det övergripande målet med detta dokument är att tillhandahålla vetenskapliga, tekniska och metodologiska detaljer på autoradiografi tekniken för att informera om vävnadsdistribution och farmakologiska analyser av protein mål.

Protocol

Alla djurhantering utfördes i enlighet med riktlinjerna från den danska djur experiment inspektorat. Obs: Det protokollet som beskrivs här omfattar vävnad förberedelse (dvsmus hjärnvävnad), in vitro- den autoradiografiska analysen i tillräcklig detalj för att ställa in metoden i ett nytt labb, exponering för fosfor imaging plattor som efterföljande Densitometrisk analys av autoradiograms (figur 2) med syftet att lokalisera och kvantif…

Representative Results

Genom att använda protokollet beskrivs, anatomiska fördelningen av de hög affinitet GHB bindningsställen var visualiseras med radioaktivt märkt GHB analoga [3H] HOCPCA i mus hjärnan, som var skuren i koronalt, sagittal och horisontella sektioner (figur 3 ). Höga nivåer av bindande observerades i hippocampus och hjärnbarken, lägre i striatum och ingen bindning identifierades i lillhjärnan, motsvarande tidigare rapporterade uttrycksmönste…

Discussion

Kvaliteten på en den autoradiografiska assay bestäms oftast av känsligheten hos radioligand. En viktig bidragande faktor är den valda radioisotop, som ges av tillgången till kända ligander eller av genomförbarheten av specifika märkning tekniker ge ligander med lämplig specifik aktivitet (dvs, det mängden radioaktivitet per enhet mol av en radioligand)²³och med begränsade mängder kemisk nedbrytning. Ett stort antal radioligands av kända ligander är märkta med tritium<sup cl…

Materials

Absolute ethanol	Merck Millipore	107017
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
BAS-TR2040 Imaging Plate	GE Healthcare Life Science	28956481	20×40 cm – Sensitive to tritium
Cresyl violet acetate	Sigma-Aldrich	C5042-10G
DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy)	Merck Millipore	100579
O.C.T. Compound, 12 x 125 mL	Sakura	4583	Tissue-Tek
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	16005-1KG-R
Superfrost Plus slides	VWR	631-9483	microscope slides
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set	Sakura Finetek Denmark ApS	4451
Tritium Standard on Glas	American Radiolabeld Chemicals, Inc.	ART 0123
Xylene substitute	Sigma-Aldrich	A5597