Høj overførselshastighed Nitrobenzoxadiazole-mærket Cholesterol Efflux Assay
Summary
Måling af in vitro-cholesterol efflux kapacitet til serum eller plasma i makrofag cell modeller er et lovende redskab som en biomarkør for åreforkalkning. I den foreliggende undersøgelse, vi optimere og standardisere en fluorescerende NBD-cholesterol efflux metode og udvikle en høj overførselshastighed analyse ved hjælp af 96-brønd plader.
Abstract
Åreforkalkning fører til hjerte-kar-sygdom (CVD). Det er stadig uklart, om kolesterol-HDL (cHDL) koncentration spiller en kausal rolle for udvikling af åreforkalkning. Men en vigtig faktor i tidlige stadier af atheroma plaque dannelse er cholesterol efflux kapacitet til HDL (HDL partikler evne til at acceptere kolesterol fra makrofager) for at undgå skum celle dannelse. Dette er et vigtigt skridt for at undgå ophobning af kolesterol i endotelet og en del af reverse kolesterol transport (RCT) at fjerne kolesterol gennem leveren. Cholesterol efflux kapacitet til serum eller plasma i makrofag cell modeller er et lovende redskab, der kan bruges som biomarkør for åreforkalkning. Traditionelt [3H]-kolesterol er blevet brugt i cholesterol efflux assays. I denne undersøgelse, vi sigter mod at udvikle en sikrere og hurtigere strategi ved hjælp af fluorescerende mærket-kolesterol (NBD-kolesterol) i en cellulær assay at spore kolesterol optagelse og efflux proces i THP-1-afledt makrofager. Endelig, vi optimere og standardisere NBD-cholesterol efflux metode og udvikle en høj overførselshastighed analyse ved hjælp af 96-brønd plader.
Introduction
Ifølge World Health Organization er de nuværende hovedårsagerne til dødsfald på verdensplan iskæmisk hjertesygdom og slagtilfælde (regnskab for i alt 15,2 millioner dødsfald)1. Begge er hjerte-kar-sygdomme (CVD), der kan indledes med åreforkalkning og ruptur af atheroma plaques i blodkar2,3.
Åreforkalkning er en fartøj væg inflammatorisk sygdom, hvor makrofager, T-celler, mastceller og dendritiske celler infiltrere endotelet og akkumulere fra blodet, til sidst danner aterosklerotiske plaques. Aterosklerotiske plaques præsentere et lipid kerne og kolesterol krystaller, fremgår af høj opløsning B-mode ultralyd målinger af carotis intima media tykkelse4,5. I makrofager udføres cholesterol efflux mod lipid acceptor partikler af middel til ATP-binding kassetten (ABC) receptorer ABCA1, ATP bindende kassette underfamilie G medlem 1 (ABCG1) og scavenger-receptor SR-BI. Ubalance i kolesterol tilstrømning og efflux i makrofager betragtes som en vigtig proces i åreforkalkning indledning6. Cholesterol efflux betragtes som et afgørende skridt i kolesterol eliminering fra perifere væv til plasma og lever i en proces kaldet reverse kolesterol transport (RCT). Kolesterol er overført fra makrofager hovedsagelig til apolipoprotein A1 (ApoA1) fundet på overfladen af high-density lipoprotein (HDL) partikler. HDLs derefter transportere cholesterol til leveren for udskillelse og genanvendelse7,8,9.
Traditionelt, har tritium (3H) radioaktivt mærket kolesterol været brugt i cholesterol efflux10. Emission signal af radioisotoper er meget følsomme10; dog præsenterer radioaktivt mærket kolesterol indlysende ulemper såsom lang protokoller, risiko for udsættelse for ioniserende stråling, og behovet for særlige radioaktivitet faciliteter og udstyr for at sikre sikker håndtering af radioaktivt udslip. Tværtimod er fluorescens blevet med held indarbejdet i diagnostiske teknikker på grund af sin enkelhed i fluorescerende signal detection, en lang række fluorophores tilgængelige, og dets sikkerhed11. Flere lysstofrør-mærket steroler har været brugt til at studere kolesterol metabolisme herunder dehydroergosterol (med iboende fluorescens), dansyl kolesterol, 4,4-difluoro-3a, 4adiaza-s-indacene (BODIPY) – kolesterol, og 22-(N-(7- Nitrobenz-2-oxa-1,3-Diazol-4-yl)amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-OL (NBD-kolesterol). Især præsenterer NBD-kolesterol en effektiv optagelse i humane celler12. To forskellige NBD mærket-kolesterol findes i øjeblikket: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) og 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-NBD; Figur 1). Kolesterol mærket med 22-NBD gruppe kan bedst passer til cholesterol efflux undersøgelser, mens 25-NBD-kolesterol bruges primært i cellulære membran dynamics forskning13,14.
Cellelinjer, der typisk anvendes i in vitro-cholesterol efflux assays er monocyt-lignende celler såsom leukæmi-afledte THP-1 celler, murine Raw 264.7 celler15eller J774.1. Alle disse celler kan være differentieret til makrofager i vitro ved hjælp af phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA), men THP-1-afledt makrofager (dmTHP-1) bedste afspejler og efterligne det menneskelige makrofager16.
I den foreliggende undersøgelse, vi optimere og standardisere en Fluorescerende høj overførselshastighed metode til at bestemme cholesterol efflux kapaciteten af serumprøver på dmTHP-1, ved hjælp af 22-NBD-kolesterol som et alternativ til [3H]-kolesterol. Desuden, sammenligner vi den optimerede fluorescerende teknik med den standard radioaktive analog.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lysstofrør-mærket kolesterol er en lovende strategi for at analysere og undersøge de egenskaber og metabolisme af naturlige kolesterol in vitro. Dens vigtigste fordele er at det kan tages op af celler, giver mulighed for intracellulære og membran distribution undersøgelser, og kan anvendes på cholesterol efflux assays som i denne protokol (figur 7). Nogle fluorescerende-mærket steroler tillade kolesterol sporing af in vitro-herunder BODIPY-kolesterol, dansyl-kolesterol, dehydroegroste…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde er blevet delvist understøttet af forskningen tilskud FIS (PS12/00866) fra Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spanien; Fondo Europeo para el Desarrollo regionale (FEDER); Red de Investigación en SIDA (RIS), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) og CERCA program / Generalitat de Catalunya. Forfatterne takke Retrovirology og Viral Immunopathology laboratorium af Institut d’Investigacions Biomèdiques August Pi I Sunyer (IDIBAPS). Vi takker T. Escribà, C. Rovira og C. Hurtado for deres bistand og S. Cufí fra viden og Technology Transfer Office for hendes vejledning i beskyttelse af opfindelsen.
Materials
| 96-well collecting plate | Corning Inc | Costar 3912 | white 96-well plate with opaque clear bottom |
| 96-well culture plate | Corning Inc | Costar 3610 | white 96-well plate with flat clear bottom |
| Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based) | Abcam | ab196985 | commercial high-throughput cell-based assay kit aimed to determine the cholesterol efflux |
| colorless RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R7509 | RPMI 1640 with no pehnol-red |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Version 2.0 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790-100G | Glycine, non-animal use |
| Luminometer | Biotek | SYNERGY HT | Multi-Detection Microplate Reader |
| Lysis Solution 1 | in-house | 50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl and H2O | |
| Lysis Solution 2 | in-house | Pure ethanol and Cell Lysis Solution 1:1 (v:v) | |
| NBD-cholesterol | Thermo-Fisher | N1148 | 22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Phosphate-buffered saline |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 202452-250G | polyethylene glycol |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | Phorbol 12-merystate B-acetate. |
| R10 | in-house | RPMI 1640 supplemented with 10 % fetal bovine serum and 5 % Penicillin/Streptomycin. | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | RPMI 1640 with 2mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose |
| THP-1 cells | Sigma-Aldrich | ATCC, #TIB-202 | monocyte-like line derived from leukemia from a one year old baby |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 |
References
- Hansson, G. K., Hermansson, A. The immune system in atherosclerosis. Nature Immunology. 12 (3), 204-212 (2011).
- Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature. 473 (7347), 317-325 (2011).
- Ilhan, F. Atherosclerosis and the role of immune cells. World Journal of Clinical Cases. 3 (4), 345 (2015).
- Greaves, D. R., Gordon, S. Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease. Trends Immunol. 22, (2001).
- Yamamoto, S., Narita, I., Kotani, K. The macrophage and its related cholesterol efflux as a HDL function index in atherosclerosis. Clinica Chimica Acta. 457, 117-122 (2016).
- Escolà-Gil, J. C., Rotllan, N., Julve, J., Blanco-Vaca, F. In vivo macrophage-specific RCT and antioxidant and antiinflammatory HDL activity measurements: New tools for predicting HDL atheroprotection. Atherosclerosis. 206 (2), 321-327 (2009).
- Santos-Gallego, C. G., Ibanez, B., Badimon, J. J. HDL-cholesterol: Is it really good? Differences between apoA-I and HDL. Biochemical Pharmacology. 76 (4), 443-452 (2008).
- Rothblat, G. H., Phillips, M. C. High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport. Current Opinion in Lipidology. 21 (3), 229-238 (2010).
- Hafiane, A., Genest, J. HDL-mediated cellular cholesterol efflux assay method. Annals of Clinical and Laboratory Science. 45 (6), 659-668 (2015).
- Szalaia, R., Hadzsiev, K., Melegh, B. Cytochrome P450 Drug Metabolizing Enzymes in Roma Population Samples: Systematic Review of the Literature. Current Medicinal Chemistry. 23, 1-26 (2016).
- Mcintosh, A. L., et al. Fluorescent Sterols for the Study of Cholesterol Trafficking in Living Cells. Probes and Tags to Study Biomolecular Function: for Proteins, RNA, and Membranes. , 1-33 (2008).
- Ostašov, P., et al. FLIM studies of 22- and 25-NBD-cholesterol in living HEK293 cells: Plasma membrane change induced by cholesterol depletion. Chemistry and Physics of Lipids. 167, 62-69 (2013).
- Song, W., et al. Characterization of fluorescent NBD-cholesterol efflux in THP-1-derived macrophages. Molecular Medicine Reports. 12 (4), 5989-5996 (2015).
- Liu, N., Wu, C., Sun, L., Zheng, J., Guo, P. Sesamin enhances cholesterol efflux in RAW264.7 macrophages. Molecules. 19 (6), 7516-7527 (2014).
- Qin, Z. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis. 221 (1), 2-11 (2012).
- Low, H., Hoang, A., Sviridov, D. Cholesterol Efflux Assay. Journal of Visualized Experiments. (61), 5-9 (2012).
- Gimpl, G., Gehrig-Burger, K. Cholesterol reporter molecules. Bioscience Reports. 27 (6), 335-358 (2007).
- Zhang, J., Cai, S., Peterson, B. R., Kris-Etherton, P. M., Heuvel, J. P. Vanden Development of a Cell-Based, High-Throughput Screening Assay for Cholesterol Efflux Using a Fluorescent Mimic of Cholesterol. ASSAY and Drug Development Technologies. 9 (2), 136-146 (2011).
- Rader, D. D. J. Molecular regulation of HDL metabolism and function: implications for novel therapies. Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3090-3100 (2006).
- Davidson, W. S., et al. The effects of apolipoprotein B depletion on HDL subspecies composition and function. Journal of Lipid Research. 57 (4), 674-686 (2016).
- Park, S. H., et al. Sage weed (Salvia plebeia) extract antagonizes foam cell formation and promotes cholesterol efflux in murine macrophages. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1105-1112 (2012).
- Litvinov, Y., Savushkin, E. V., Garaeva, E. A. D. A. Cholesterol Efflux and Reverse Cholesterol Transport: Experimental Approaches. Current Medicinal Chemistry. 371 (25), 2383-2393 (2016).
- Phillips, A., Mucksavage, M. L., Wilensky, R. L., Mohler, E. R. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364 (2), 127-135 (2011).
- Rohatgi, A., et al. HDL Cholesterol Efflux Capacity and Incident Cardiovascular Events. New England Journal of Medicine. 371 (25), 2383-2393 (2014).
