Haut-débit Nitrobenzoxadiazole marqué cholestérol Efflux Assay
Summary
Mesure de la capacité de l’efflux de cholestérol in vitro de sérum ou de plasma dans les modèles de cellules macrophages est un outil prometteur comme biomarqueur d’athérosclérose. Dans la présente étude, nous optimiser et uniformiser une méthode d’efflux de cholestérol NBD fluorescente et développer une analyse de haut-débit à l’aide de plaques de 96 puits.
Abstract
L’athérosclérose entraîne des maladies cardiovasculaires (MCV). On ignore encore si la concentration de cholestérol-HDL (cHDL) joue un rôle causal dans le développement de l’athérosclérose. Cependant, un facteur important dans les premiers stades de la formation de plaques d’athérome est capacité de l’efflux de cholestérol HDL (la capacité des particules HDL à accepter le cholestérol des macrophages) afin d’éviter la formation de cellules de mousse. Il s’agit d’une étape clé en évitant l’accumulation de cholestérol dans l’endothélium et une partie du transport du cholestérol inverse (RCT) à éliminer le cholestérol par le foie. Capacité de l’efflux de cholestérol de sérum ou de plasma dans les modèles de cellules macrophages est un outil prometteur qui peut être utilisé comme biomarqueur d’athérosclérose. Traditionnellement, [3H]-cholestérol a été utilisé lors d’essais de l’efflux de cholestérol. Dans cette étude, notre objectif est d’élaborer une stratégie plus sûre et plus rapide à l’aide de fluorescent étiquetés-cholestérol (NBD) lors d’un test cellulaire de retracer le processus de captation et l’efflux de cholestérol dans les macrophages dérivés du THP-1. Enfin, optimiser et uniformiser la méthode de l’efflux de cholestérol NBD et développer une analyse de haut-débit à l’aide de plaques de 96 puits.
Introduction
Selon l’organisation mondiale de la santé, les cours principales causes de décès dans le monde sont les cardiopathies ischémiques et les accidents vasculaires cérébraux (représentant un total de 15,2 millions de décès)1. Les deux sont des maladies cardiovasculaires (MCV) qui peuvent être précédées de l’athérosclérose et la rupture des plaques d’athérome dans les vaisseaux sanguins2,3.
L’athérosclérose est une maladie inflammatoire de mur du navire dans laquelle macrophages, lymphocytes T, cellules de mât et les cellules dendritiques infiltrent l’endothélium et s’accumulent dans le sang, formant éventuellement les plaques d’athérome. Les plaques d’athérosclérose présentent un lipide cristaux cœur et cholestérol, attestées par des mesures de l’échographie mode B haute résolution de la carotide intima média épaisseur4,5. Dans les macrophages, efflux de cholestérol vers des particules lipidiques accepteur est effectué par des moyens des récepteurs ATP binding cassette (ABC) ABCA1, ATP binding cassette membre du subfamily G 1 (ABCG1) et le récepteur éboueur SR-BI. Le déséquilibre des influx de cholestérol et l’efflux dans les macrophages est considéré comme un processus clé de l’athérosclérose initiation6. Efflux de cholestérol est considéré comme une étape clé dans l’élimination du cholestérol des tissus périphériques au plasma et le foie dans un processus appelé transport du cholestérol inverse (RCT). Cholestérol est transférée de macrophages principalement d’apolipoprotéine A1 (ApoA1) dans la surface des particules de lipoprotéines de haute densité (HDL). Puis le transport HDL cholestérol vers le foie pour l’excrétion et réutilisation7,8,9.
Traditionnellement, cholestérol radiomarqué de tritium (3H) a été utilisé dans l’efflux de cholestérol10. Le signal d’émission de radioisotopes est hautement sensible10; Cependant, cholestérol radiomarqué présente des handicaps évidents tels que les protocoles longs, risque d’exposition aux rayonnements ionisants et la nécessité de radioactivité spécial installations et le matériel assurer une manipulation sûre des émissions radioactives. Au contraire, la fluorescence a été avec succès incorporé dans des techniques de diagnostic en raison de sa simplicité dans la détection de signal fluorescent, la grande variété des fluorophores disponibles et sa sécurité11. Plusieurs des stérols fluorescentes marquées ont été utilisés pour étudier le métabolisme du cholestérol notamment dehydroergosterol (avec fluorescence intrinsèque), cholestérol dansyl, 4,4-difluoro-3 a, 4adiaza-s-indacene (BODIPY) – cholestérol et 22-(N-(7- Nitrobenz-2-oxa-1,3-Diazol-4-YL)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-OL (NBD-cholestérol). En particulier, NBD-cholestérol présente une absorption efficace dans les cellules humaines12. Deux différentes NBD étiquetés-cholestérol n’est actuellement disponible : 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) et 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-jour ouvrable suivant ; La figure 1). Cholestérol marqué avec portion de 22-NBD peut mieux à des études de l’efflux de cholestérol, tandis que 25-NBD-cholestérol est principalement utilisé dans la membrane cellulaire dynamique recherche13,14.
Lignées cellulaires généralement utilisées dans les essais de l’efflux de cholestérol in vitro sont des cellules de type monocyte comme des cellules THP-1 leucémie-dérivé humaines, murines Raw 264.7 cellules15ou J774.1. Toutes ces cellules se différencient en macrophages in vitro à l’aide de phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA), mais les macrophages dérivés du THP-1 (dmTHP-1) mieux reflètent et imitent les macrophages humains16.
Dans la présente étude, nous avons optimiser et uniformiser une méthode fluorescente de haut débit afin de déterminer la capacité de l’efflux de cholestérol du sérum sur dmTHP-1, à l’aide de 22-NBD-cholestérol comme une alternative à la [3H]-cholestérol. En outre, nous comparons la technique fluorescente optimisée avec l’analogue radioactif standard.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cholestérol marqué fluorescent est une stratégie prometteuse pour analyser et étudier les propriétés et le métabolisme du cholestérol naturel in vitro. Ses principaux avantages sont qu’il peut être absorbé par les cellules, permettant l’intracellulaire et étude de membrane de diffusion et peut être appliqué à des épreuves de l’efflux de cholestérol comme dans ce protocole (Figure 7). Certains stérols fluorescentes marqués permettent de cholestérol suivi in vitro y co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été partiellement soutenu par la subventions de recherche FIS (PS12/00866) d’Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Espagne ; El de Fondo Europeo para Desarrollo régional (FEDER) ; Red de Investigación en SIDA (RIS), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) et Programme de CERCA / Generalitat de Catalunya. Les auteurs remercient la rétrovirologie et laboratoire d’immunopathologie virale de l’Institut d’Investigacions Biomèdiques août Pi I Sunyer (IDIBAPS). Nous remercions Escribà T., c. Rovira et C. Hurtado pour leur aide et S. Cufí de la connaissance et le bureau de transfert de technologie pour son orientation dans la protection de l’invention.
Materials
| 96-well collecting plate | Corning Inc | Costar 3912 | white 96-well plate with opaque clear bottom |
| 96-well culture plate | Corning Inc | Costar 3610 | white 96-well plate with flat clear bottom |
| Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based) | Abcam | ab196985 | commercial high-throughput cell-based assay kit aimed to determine the cholesterol efflux |
| colorless RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R7509 | RPMI 1640 with no pehnol-red |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Version 2.0 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790-100G | Glycine, non-animal use |
| Luminometer | Biotek | SYNERGY HT | Multi-Detection Microplate Reader |
| Lysis Solution 1 | in-house | 50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl and H2O | |
| Lysis Solution 2 | in-house | Pure ethanol and Cell Lysis Solution 1:1 (v:v) | |
| NBD-cholesterol | Thermo-Fisher | N1148 | 22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Phosphate-buffered saline |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 202452-250G | polyethylene glycol |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | Phorbol 12-merystate B-acetate. |
| R10 | in-house | RPMI 1640 supplemented with 10 % fetal bovine serum and 5 % Penicillin/Streptomycin. | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | RPMI 1640 with 2mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose |
| THP-1 cells | Sigma-Aldrich | ATCC, #TIB-202 | monocyte-like line derived from leukemia from a one year old baby |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 |
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