Hochdurchsatz-Nitrobenzoxadiazole-Label Cholesterin-Efflux-Assay
Summary
Messung der in-vitro-Cholesterin Efflux Fähigkeit, Serum oder Plasma in Makrophagen Zellmodellen ist ein viel versprechendes Instrument als Biomarker für Atherosklerose. In der vorliegenden Studie wir optimieren und standardisieren eine fluoreszierende NBD-Cholesterin-Efflux-Methode und eine Hochdurchsatz-Analyse mit 96-Well Platten zu entwickeln.
Abstract
Arteriosklerose führt zu Herz-Kreislauf-Krankheit (CVD). Es ist noch unklar, ob Cholesterin HDL (cHDL) Konzentration spielt eine ursächliche Rolle in der Entwicklung von Atherosklerose. Allerdings ist ein wichtiger Faktor in frühen Stadien der Atherom Plaquebildung Cholesterin Efflux Fähigkeit, HDL (die Fähigkeit der HDL-Partikel, Cholesterin aus Makrophagen anzunehmen) um Zelle Schaumbildung zu vermeiden. Dies ist ein wichtiger Schritt bei der Vermeidung der Anhäufung von Cholesterin in das Endothel und ein Teil des umgekehrten Cholesterin-Transport (RCT), Cholesterin durch die Leber zu beseitigen. Cholesterin Efflux Fähigkeit, Serum oder Plasma in Makrophagen Zellmodellen ist ein viel versprechendes Instrument, das als Biomarker für Atherosklerose verwendet werden kann. Traditionell, [3H]-Cholesterin in Cholesterin-Efflux-Assays verwendet worden. In dieser Studie wollen wir ein sicherer und schneller mit fluoreszierenden gekennzeichnet-Cholesterin (NBD-Cholesterin)-Strategie in einem zellulären Assay, den Cholesterin Aufnahme und Fluth Prozess in THP-1-derived Makrophagen zu verfolgen. Endlich, wir optimieren und standardisieren die NBD-Cholesterin-Efflux-Methode und eine Hochdurchsatz-Analyse mit 96-Well Platten zu entwickeln.
Introduction
Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation sind die aktuellen wichtigsten Todesursachen weltweit ischämischen Herzkrankheiten und Schlaganfall (Buchhaltung für insgesamt 15,2 Millionen Todesfälle)1. Beide sind Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD), die Arteriosklerose und der Bruch des Atheroms Plaques in Blutgefäßen2,3vorangestellt werden können.
Atherosklerose ist ein Schiff Wand entzündliche Erkrankung in der T-Zellen, Makrophagen, Mastzellen und dendritischen Zellen infiltrieren das Endothel und sammeln aus dem Blut, schließlich bildet arteriosklerotische Plaques. Arteriosklerotische Plaques präsentieren ein Lipid Kern und Cholesterin-Kristalle, belegt durch hochauflösende B-Mode Sonographie Messungen der a. carotis Intima Media Dicke4,5. In Makrophagen wird Cholesterin Efflux zur Lipid-Akzeptor-Partikel mit Mitteln der ATP-bindende Kassette (ABC) Rezeptoren ABCA1, ATP verbindliche Kassette Unterfamilie G Mitglied 1 (ABCG1) und der Scavenger-Rezeptor SR-BI durchgeführt. Das Ungleichgewicht der Cholesterin Zustrom und Fluth in Makrophagen gilt ein Schlüsselprozess bei Arteriosklerose Einleitung6. Cholesterin-Efflux gilt als ein wichtiger Schritt in der Cholesterin-Beseitigung von peripheren Gewebe in das Plasma und Leber in einem Prozess namens reverse Cholesterin-Transport (RCT). Cholesterin wird von Makrophagen hauptsächlich an Apolipoprotein A1 (ApoA1) gefunden auf der Oberfläche des High-density-Lipoprotein (HDL) Teilchen übertragen. HDLs transportieren dann Cholesterin zur Leber für die Ausscheidung und Verwertung7,8,9.
Traditionell hat Tritium (3H) radioaktiv markierten Cholesterin Cholesterin Efflux10eingesetzt. Die Emission Signal von Radioisotopen ist hochempfindlichen10; Allerdings stellt die radioaktiv markierten Cholesterin offensichtliche Nachteilen wie lange Protokolle, Risiko einer Exposition gegenüber ionisierender Strahlung und die Notwendigkeit für spezielle Radioaktivität Einrichtungen und Anlagen zum sicheren Umgang mit radioaktiven Emissionen zu gewährleisten. Fluoreszenz ist hingegen erfolgreich in diagnostischen Techniken aufgrund seiner Einfachheit in fluoreszierenden Signalerkennung, die unterschiedlichsten Fluorophore verfügbar und seine Sicherheit11aufgenommen worden. Mehrere Leuchtstofflampen gekennzeichnet Sterole wurden verwendet, um Cholesterin-Stoffwechsel einschließlich Dehydroergosterol (mit intrinsische Fluoreszenz), Dansyl Cholesterin, 4,4-Difluoro-3a, 4adiaza-s-Indacene (BODIPY) studieren – Cholesterin und 22-(N) (7) Nitrobenz-2-oxa-1,3-Diazol-4-YL)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-OL (NBD-Cholesterin). Insbesondere stellt NBD-Cholesterin eine effiziente Aufnahme in menschlichen Zellen12. Derzeit gibt es zwei verschiedene NBD gekennzeichnet-Cholesterin: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) und 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-NBD; ( Abbildung 1). Cholesterin mit 22-NBD glyko-gekennzeichnet kann Cholesterin-Efflux-Studien, am besten passen, während 25-NBD-Cholesterin hauptsächlich in Zellmembran Dynamik Forschung13,14verwendet wird.
Zell-Linien in der Regel verwendet in in-vitro-Cholesterin-Efflux-Assays sind Monocyte-wie Zellen wie menschliche Leukämie abgeleitet THP-1-Zellen, murine Raw 264,7 Zellen15oder J774.1. Alle diese Zellen differenzieren sich in Makrophagen in Vitro mit Phorbol Myristate-12 13-Acetat (PMA), aber THP-1-derived Makrophagen (DmTHP-1) am besten widerspiegeln und imitieren die menschliche Makrophagen16.
In der vorliegenden Studie, wir optimieren und standardisieren eine fluoreszierende Hochdurchsatz-Methode auf, um die Cholesterin-Efflux-Kapazität der Serumproben auf DmTHP-1, ermitteln mit 22-NBD-Cholesterin als Alternative zu [3H]-Cholesterin. Darüber hinaus vergleichen wir die optimierte fluoreszierende Technik mit dem standard radioaktiven analogen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Leuchtstoff-gekennzeichnete Cholesterin ist eine vielversprechende Strategie analysieren und untersuchen die Eigenschaften und den Stoffwechsel von in-vitro-natürliche Cholesterin. Die wichtigsten Vorteile sind, dass es von den Zellen aufgenommen werden kann, ermöglicht die intrazellulären und Membran Reichweitenstudien und können auch auf Cholesterin Efflux-Assays wie in diesem Protokoll (Abbildung 7). Einige Leuchtstofflampen gekennzeichnet Sterole ermöglichen Cholesterin tracking in-…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise von unterstützt die Forschung gewährt FIS (PS12/00866) vom Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spanien; Fondo Europeo Para el Desarrollo Regional (FEDER); Red de Investigación En SIDA (RIS), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) und CERCA Programm / Generalitat de Catalunya. Die Autoren danken den Retrovirology und virale Immunpathologie Labor des Institut d’Investigacions Biomèdiques August Pi I Sunyer (IDIBAPS). Wir danken T. Escribà, C. Rovira und C. Hurtado für ihre Unterstützung und S. Cufí vom Wissen und der Technologie-Transfer-Büro für ihre Führung in der Erfindung zu schützen.
Materials
| 96-well collecting plate | Corning Inc | Costar 3912 | white 96-well plate with opaque clear bottom |
| 96-well culture plate | Corning Inc | Costar 3610 | white 96-well plate with flat clear bottom |
| Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based) | Abcam | ab196985 | commercial high-throughput cell-based assay kit aimed to determine the cholesterol efflux |
| colorless RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R7509 | RPMI 1640 with no pehnol-red |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Version 2.0 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790-100G | Glycine, non-animal use |
| Luminometer | Biotek | SYNERGY HT | Multi-Detection Microplate Reader |
| Lysis Solution 1 | in-house | 50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl and H2O | |
| Lysis Solution 2 | in-house | Pure ethanol and Cell Lysis Solution 1:1 (v:v) | |
| NBD-cholesterol | Thermo-Fisher | N1148 | 22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Phosphate-buffered saline |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 202452-250G | polyethylene glycol |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | Phorbol 12-merystate B-acetate. |
| R10 | in-house | RPMI 1640 supplemented with 10 % fetal bovine serum and 5 % Penicillin/Streptomycin. | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | RPMI 1640 with 2mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose |
| THP-1 cells | Sigma-Aldrich | ATCC, #TIB-202 | monocyte-like line derived from leukemia from a one year old baby |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 |
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