उच्च प्रवाह Nitrobenzoxadiazole-समाप्ति कोलेस्ट्रॉल परख लेबल
Summary
मापन इन विट्रो में कोलेस्ट्रॉल समाप्ति क्षमता सीरम या प्लाज्मा मैक्रोफेज सेल मॉडल में atherosclerosis के लिए एक के रूप में एक होनहार उपकरण है । वर्तमान अध्ययन में, हम अनुकूलन और एक फ्लोरोसेंट NBD-कोलेस्ट्रॉल समाप्ति विधि मानकीकरण और एक उच्च प्रवाह ९६-well प्लेट्स का उपयोग कर विश्लेषण का विकास ।
Abstract
Atherosclerosis हृदय रोग (सीवीडी) की ओर जाता है । यह अभी भी स्पष्ट नहीं है कि कोलेस्ट्रॉल एचडीएल (cHDL) एकाग्रता atherosclerosis विकास में एक कारण भूमिका निभाता है । हालांकि, मेदार्बुद पट्टिका गठन के प्रारंभिक दौर में एक महत्वपूर्ण कारक कोलेस्ट्रॉल समाप्ति क्षमता एचडीएल (एचडीएल कणों मैक्रोफेज से कोलेस्ट्रॉल को स्वीकार करने की क्षमता) के क्रम में फोम सेल गठन से बचने के लिए है । इस endothelium में कोलेस्ट्रॉल के संचय और जिगर के माध्यम से कोलेस्ट्रॉल को खत्म करने के लिए रिवर्स कोलेस्ट्रॉल परिवहन (RCT) का एक हिस्सा से बचने में एक महत्वपूर्ण कदम है । मैक्रोफेज सेल मॉडल में सीरम या प्लाज्मा को कोलेस्ट्रॉल समाप्ति क्षमता एक होनहार उपकरण है जिसे atherosclerosis के लिए रिमार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । परंपरागत रूप से, [3एच]-कोलेस्ट्रॉल में कोलेस्ट्रॉल समाप्ति की परख का प्रयोग किया गया है । इस अध्ययन में, हम एक सेलुलर परख में फ्लोरोसेंट बला-कोलेस्ट्रॉल (NBD-कोलेस्ट्रॉल) का उपयोग कर एक सुरक्षित और तेजी से रणनीति विकसित करने के लिए THP-1-व्युत्पंन मैक्रोफेज में कोलेस्ट्रॉल तेज और समाप्ति प्रक्रिया का पता लगाने के उद्देश्य । अंत में, हम अनुकूलन और NBD-कोलेस्ट्रॉल समाप्ति विधि का मानकीकरण और एक उच्च प्रवाह ९६-अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग विश्लेषण का विकास ।
Introduction
विश्व स्वास्थ्य संगठन के अनुसार, दुनिया भर में मौत के वर्तमान प्रमुख कारणों कोरोनरी हृदय रोग और स्ट्रोक (१५,२००,००० मौतों की कुल के लिए लेखांकन)1हैं । दोनों हृदय रोग (सीवीडी) है कि atherosclerosis और रक्त वाहिकाओं2,3में मेदार्बुद सजीले टुकड़े का टूटना से पहले किया जा सकता है ।
Atherosclerosis एक पोत दीवार भड़काऊ रोग है जिसमें मैक्रोफेज, टी कोशिकाओं, मस्तूल कोशिकाओं, और वृक्ष कोशिकाओं endothelium घुसपैठ और खून से संचित, अंततः atherosclerotic सजीले टुकड़े बनाने । Atherosclerotic सजीले टुकड़े एक लिपिड कोर और कोलेस्ट्रॉल क्रिस्टल प्रस्तुत, मन्या intima मीडिया मोटाई4,5के उच्च संकल्प बी मोड ट्रा माप के द्वारा सबूत. मैक्रोफेज में, लिपिड स्वीकारकर्ता कणों की ओर कोलेस्ट्रॉल समाप्ति एटीपी बाध्यकारी कैसेट (एबीसी) रिसेप्टर्स ABCA1 के माध्यम से किया जाता है, एटीपी बाइंडिंग कैसेट उपपरिवार जी सदस्य 1 (ABCG1), और मेहतर रिसेप्टर SR-द्वि. मैक्रोफेज में कोलेस्ट्रॉल की आमद और समाप्ति के असंतुलन को atherosclerosis दीक्षा6में एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया माना जाता है । कोलेस्ट्रॉल समाप्ति परिधीय ऊतक से प्लाज्मा और जिगर को रिवर्स कोलेस्ट्रॉल परिवहन (RCT) नामक प्रक्रिया में कोलेस्ट्रॉल उन्मूलन में एक महत्वपूर्ण कदम माना जाता है । कोलेस्ट्रॉल मैक्रोफेज से मुख्य रूप से apolipoprotein A1 (ApoA1) उच्च घनत्व लिपोप्रोटीन (एचडीएल) कणों की सतह पर पाया स्थानांतरित किया जाता है । डेंसिटी तो उत्सर्जन के लिए जिगर को कोलेस्ट्रॉल परिवहन और पुन: उपयोग7,8,9।
परंपरागत रूप से tritium (3एच) रेडियो-बला कोलेस्ट्रॉल का इस्तेमाल कोलेस्ट्रॉल समाप्ति10में किया गया है । radioisotopes का उत्सर्जन संकेत अति संवेदनशील10है; हालांकि, रेडियो-लेबल कोलेस्ट्रॉल इस तरह के लंबे प्रोटोकॉल के रूप में स्पष्ट बाधाओं प्रस्तुत करता है, विकिरण के लिए जोखिम के जोखिम, और विशेष रेडियोधर्मिता सुविधाओं और रेडियोधर्मी उत्सर्जन की सुरक्षित हैंडलिंग सुनिश्चित करने के लिए उपकरणों के लिए की जरूरत है । इसके विपरीत, प्रतिदीप्ति सफलतापूर्वक फ्लोरोसेंट संकेत का पता लगाने में अपनी सादगी के कारण नैदानिक तकनीक में शामिल किया गया है, उपलब्ध fluorophores की व्यापक विविधता है, और अपनी सुरक्षा11. कई फ्लोरोसेंट-बला sterols dehydroergosterol सहित कोलेस्ट्रॉल चयापचय का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है (आंतरिक प्रतिदीप्ति के साथ), dansyl कोलेस्ट्रॉल, 4, 4-difluoro-3 ए, 4adiaza-s-indacene (BODIPY)-कोलेस्ट्रॉल, और 22-(एन-(7- Nitrobenz-2-Oxa-1, 3-Diazol-4-yl) अमीनो)-23, 24-Bisnor-5-Cholen-3β-राजभाषा (NBD-cholesterol) । विशेष रूप से, NBD-कोलेस्ट्रॉल मानव कोशिकाओं12में एक कुशल सुलाने के लिए प्रस्तुत करता है । दो अलग NBD बला-कोलेस्ट्रॉल वर्तमान में उपलब्ध हैं: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1, 3-diazol-4-yl) अमीनो)-23, 24-bisnor-5-cholen-3 बी-राजभाषा (22-NBD) और 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1, 3-diazol-4-yl)-मिथाइल] अमीनों) -27-norcholesterol (25-NBD; चित्रा 1) । कोलेस्ट्रॉल 22-NBD moiety के साथ लेबल सबसे अच्छा कोलेस्ट्रॉल समाप्ति अध्ययन के अनुरूप हो सकता है, जबकि 25-NBD-कोलेस्ट्रॉल मुख्य रूप से सेलुलर झिल्ली गतिशीलता अनुसंधान13,14में प्रयोग किया जाता है ।
सेल आमतौर पर इन विट्रो में प्रयुक्त लाइनों कोलेस्ट्रॉल समाप्ति परख monocyte जैसे मानव ल्यूकेमिया-व्युत्पंन THP-1 कोशिकाओं, murine कच्चे २६४.७ कोशिकाओं15, या जंमू 774.1 जैसे कोशिकाओं रहे हैं । इन कोशिकाओं के सभी phorbol 12-myristate 13-एसीटेट (पमा) का उपयोग कर इन विट्रो में मैक्रोफेज में विभेद किया जा सकता है, लेकिन THP-1-व्युत्पंन मैक्रोफेज (dmTHP-1) सबसे अच्छा प्रतिबिंबित और मानव मैक्रोफेज16नकल ।
वर्तमान अध्ययन में, हम ऑप्टिमाइज़ करें और dmTHP-1 पर सीरम नमूनों की कोलेस्ट्रॉल समाप्ति क्षमता का निर्धारण करने के लिए एक फ्लोरोसेंट उच्च-प्रवाह विधि मानकीकरण, 22-NBD-कोलेस्ट्रॉल के लिए एक विकल्प के रूप में उपयोग करना [3H]-कोलेस्ट्रॉल. इसके अलावा, हम मानक रेडियोधर्मी एनालॉग के साथ अनुकूलित फ्लोरोसेंट तकनीक की तुलना करें ।
Protocol
Representative Results
Discussion
फ्लोरोसेंट लेबल कोलेस्ट्रॉल एक आशाजनक रणनीति का विश्लेषण और गुणों और प्राकृतिक कोलेस्ट्रॉल के चयापचय की जांच इन विट्रो में है । इसका मुख्य लाभ यह है कि यह कोशिकाओं द्वारा लिया जा सकता है, intracellular और झिल्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस कार्य को Instituto डी Salud कार्लोस III, मैड्रिड, स्पेन से अनुसंधान अनुदान वित्तीय संस्थाओं (PS12/00866) द्वारा आंशिक रूप से समर्थित किया गया है; Fondo Europeo पैरा एल Desarrollo रिजनल (FEDER); Red de Investigación en सीडा (RIS), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) और CERCA कार्यक्रम/Generalitat डे Catalunya । लेखकों ने Institut d’Investigacions Biomèdiques अगस्त पीआई आइ Sunyer (IDIBAPS) की Retrovirology और वायरल Immunopathology प्रयोगशाला का धन्यवाद किया । हम Escribà, सी. Rovira, और सी. Hurtado उनकी सहायता के लिए धंयवाद और ज्ञान और प्रौद्योगिकी के स्थानांतरण कार्यालय से Cufí आविष्कार की रक्षा में उसके मार्गदर्शन के लिए ।
Materials
| 96-well collecting plate | Corning Inc | Costar 3912 | white 96-well plate with opaque clear bottom |
| 96-well culture plate | Corning Inc | Costar 3610 | white 96-well plate with flat clear bottom |
| Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based) | Abcam | ab196985 | commercial high-throughput cell-based assay kit aimed to determine the cholesterol efflux |
| colorless RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R7509 | RPMI 1640 with no pehnol-red |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Version 2.0 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790-100G | Glycine, non-animal use |
| Luminometer | Biotek | SYNERGY HT | Multi-Detection Microplate Reader |
| Lysis Solution 1 | in-house | 50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl and H2O | |
| Lysis Solution 2 | in-house | Pure ethanol and Cell Lysis Solution 1:1 (v:v) | |
| NBD-cholesterol | Thermo-Fisher | N1148 | 22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Phosphate-buffered saline |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 202452-250G | polyethylene glycol |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | Phorbol 12-merystate B-acetate. |
| R10 | in-house | RPMI 1640 supplemented with 10 % fetal bovine serum and 5 % Penicillin/Streptomycin. | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | RPMI 1640 with 2mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose |
| THP-1 cells | Sigma-Aldrich | ATCC, #TIB-202 | monocyte-like line derived from leukemia from a one year old baby |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 |
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