高スループット Nitrobenzoxadiazole ラベル コレステロール排出アッセイ
Summary
血清または血漿マクロファージ細胞モデルの in vitro におけるコレステロール排出能力の測定は、動脈硬化症のバイオ マーカーとして有望なツールです。本研究で我々 は、蛍光 NBD コレステロール排出法を標準化して 96 ウェルのプレートを用いた高スループット解析を開発を最適化します。
Abstract
動脈硬化は、心血管疾患 (CVD) に します。コレステロール HDL (cHDL) 濃度が動脈硬化の進展に因果的役割を果たしているかどうかは不明です。しかし、アテローマ プラーク形成の初期段階に重要な要因は HDL (大食細胞からコレステロールを受け入れるように HDL 粒子の能力) はコレステロール排出容量泡沫細胞の形成を避けるために。これは、血管内皮細胞との逆のコレステロールの輸送 (RCT) 肝臓でコレステロールを排除するために一部のコレステロールの蓄積を回避する上で重要なステップです。血清またはマクロファージ細胞モデルにおける血漿コレステロール排出能力は、アテローム性動脈硬化のマーカーとして使用できる有望なツールです。伝統的に、[3H]-コレステロールは、コレステロール排出試金で使用されています。本研究では THP-1 由来マクロファージのコレステロール摂取量と流出プロセスをトレースするアッセイで蛍光標識コレステロール (NBD コレステロール) を使用してより安全でより高速な戦略を開発する目指しています。最後に、我々 は、最適化 NBD コレステロール排出方法を標準化、96 ウェルのプレートを用いた高スループット解析を開発します。
Introduction
世界保健機関によると、死の世界の現在の主な原因は虚血性心疾患と脳卒中 (1520 万の死の合計のための会計)1。どちらも、動脈硬化や血管の2,3アテローム斑の破裂によって付けることができます心血管疾患 (CVD)。
動脈硬化は、血管壁炎症性疾患、マクロファージ、T 細胞、肥満細胞、樹状細胞、血管内皮細胞に潜入し、最終的に動脈硬化性プラークを形成、血から蓄積です。動脈硬化性プラークは脂質に頸動脈内膜メディアの厚さ4、5の高解像度の B モード超音波測定によって立証される、コアとコレステロールの結晶を提示します。マクロファージ、脂質受容体粒子へのコレステロール排出 (ABCG1) ATP 結合カセット (ABC) 受容体 ABCA1、ATP 結合カセット亜科 G メンバー 1 の手段とスカベン ジャー受容体 SR 双方向で実行されます。コレステロールの流入と流出マクロファージの不均衡は、アテローム性動脈硬化開始6キー プロセスと見なされます。プラズマに末梢の組織からコレステロール除去の重要なステップ、逆のコレステロールの輸送 (RCT) と呼ばれるプロセスで肝臓コレステロール排出であります。コレステロールは、主にアポリポ蛋白 A1 (ApoA1) 見つけられる大食細胞高密度リポタンパク質 (HDL) 粒子の表面にから転送されます。Hdl は、排泄と再利用の7,8,9の肝臓へのコレステロールを輸送します。
伝統的に、トリチウム (3H) ラジオ ラベル コレステロールは、コレステロール排出10で使用されています。放射性同位元素の発光信号が高感度10;但し、無線標識のコレステロールは長いプロトコル、電離放射線への暴露のリスクと放射性排出物の安全な取り扱いを確保するため特別な放射能設備と機器の必要性など明らかな障害を示します。それどころか、蛍光は蛍光信号検出、さまざまな fluorophores が付いて、およびその安全性11の単純さのための診断技術で正常に組み込まれています。いくつか蛍光標識ステロールは、コレステロールの代謝 (蛍光) と dehydroergosterol, ダンシル コレステロール, 4, 4-フッ素-3 a、4adiaza s indacene を含む (団) を研究に使用されている – コレステロール、および 22-(n-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol (NBD コレステロール)。特に、NBD コレステロールは人間の細胞12の効率的な吸収を示します。2 つ異なる NBD ラベル-コレステロールは、現在利用可能な: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) と 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-NBD;図 1)。コレステロール 22 NBD 部が付いた可能性がありますコレステロール排出研究合わせて最高 25 NBD コレステロールは細胞膜のダイナミクス研究13,14で主に使用します。
通常コレステロールの体外排出の試金で使用される細胞は、THP 1 ひと白血病細胞、マウスの未加工 264.7 のセルの15、J774.1 など単球のようなセルです。ホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート (PMA) を用いてマクロファージに分化可能これらのセルのすべてが、THP-1 由来マクロファージ (dmTHP-1) ベスト反映、ヒトマクロファージ16を模倣します。
本研究では、最適化し、代わりに [3H] 22 NBD コレステロールを使用して dmTHP – 1、血清のコレステロール排出容量を決定する蛍光高スループット方法を標準化-コレステロール。さらに、我々 は標準的な放射性アナログと最適化された蛍光法を比較します。
Protocol
Representative Results
Discussion
蛍光標識されたコレステロールは、分析してプロパティおよび自然なコレステロールの体外代謝を調べる有望な戦略です。その主な利点は、それは、細胞内では、細胞によってとることができる膜分布研究科このプロトコル (図 7) のようにこのようなコレステロール排出アッセイを適用ことができます。いくつかの蛍光標識ステロールは、BODIPY コレステロール、ダンシ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、部分的に支えられてきた研究は、セルバンテス ・ デ ・ サラッド カルロス III、マドリード、スペインから FIS (PS12/00866) を付与フォンド Europeo パラ エル開発地域 (フェダー);レッド ・ デ ・危惧アン SIDA (RIS) ISCIII 主任 (RD16/0025/0002)、CERCA プログラム/ジャナラリター ・ デ ・ カタルーニャ。レトロ ウイルス免疫病理学講座研究所 d’Investigacions Biomèdiques 8 月 Pi 私スニェ (IDIBAPS) を著者に感謝します。発明を保護する上で彼女の指導のため彼らの支援と知識と技術移転オフィスから s. Cufí、t. Escribà、C. Rovira と C. フルタドに感謝します。
Materials
| 96-well collecting plate | Corning Inc | Costar 3912 | white 96-well plate with opaque clear bottom |
| 96-well culture plate | Corning Inc | Costar 3610 | white 96-well plate with flat clear bottom |
| Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based) | Abcam | ab196985 | commercial high-throughput cell-based assay kit aimed to determine the cholesterol efflux |
| colorless RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R7509 | RPMI 1640 with no pehnol-red |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Version 2.0 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790-100G | Glycine, non-animal use |
| Luminometer | Biotek | SYNERGY HT | Multi-Detection Microplate Reader |
| Lysis Solution 1 | in-house | 50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl and H2O | |
| Lysis Solution 2 | in-house | Pure ethanol and Cell Lysis Solution 1:1 (v:v) | |
| NBD-cholesterol | Thermo-Fisher | N1148 | 22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Phosphate-buffered saline |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 202452-250G | polyethylene glycol |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | Phorbol 12-merystate B-acetate. |
| R10 | in-house | RPMI 1640 supplemented with 10 % fetal bovine serum and 5 % Penicillin/Streptomycin. | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | RPMI 1640 with 2mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose |
| THP-1 cells | Sigma-Aldrich | ATCC, #TIB-202 | monocyte-like line derived from leukemia from a one year old baby |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 |
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