Ensaio de efluxo de colesterol Nitrobenzoxadiazole-etiquetadas do elevado-throughput
Summary
Medição da capacidade de efluxo de colesterol in vitro de soro ou plasma em modelos de celular de macrófagos é uma ferramenta promissora como um biomarcador para a aterosclerose. No presente estudo, podemos otimizar e padronizar um método de efluxo de colesterol NBD fluorescente e desenvolver uma análise do elevado-throughput usando placas de 96 poços.
Abstract
Aterosclerose leva a doenças cardiovasculares (DCV). Ainda não está claro se a concentração de colesterol-HDL (cHDL) desempenha um papel causal no desenvolvimento de aterosclerose. No entanto, um fator importante nas fases iniciais da formação da placa de ateroma é a capacidade de efluxo de colesterol HDL (a capacidade de partículas de HDL de colesterol de macrófagos de aceitar) para evitar a formação de células de espuma. Este é um passo chave para evitar o acúmulo de colesterol no endotélio e uma parte do transporte reverso de colesterol (RCT) para eliminar o colesterol através do fígado. Capacidade de efluxo de colesterol de soro ou plasma em modelos de celular macrófago é uma ferramenta promissora que pode ser usada como um biomarcador para a aterosclerose. Tradicionalmente, [3H]-colesterol tem sido usado em ensaios de efluxo de colesterol. Neste estudo, pretendemos desenvolver uma estratégia mais segura e mais rápida usando fluorescente rotulados-colesterol (colesterol-NBD) em um ensaio de celular para rastrear o processo de absorção e efluxo de colesterol em macrófagos THP-1-derivado. Finalmente, podemos otimizar e padronizar o método de efluxo de colesterol NBD e desenvolver uma análise do elevado-throughput usando placas de 96 poços.
Introduction
De acordo com a Organização Mundial de saúde, principais causas de morte no mundo atuais são doenças isquêmicas do coração e acidente vascular cerebral (contabilizando um total de 15,2 milhões de mortes)1. Ambas são doenças cardiovasculares (DCV) que podem ser precedidas por aterosclerose e a ruptura de placas de ateroma nos vasos sanguíneos2,3.
A aterosclerose é uma doença inflamatória vaso parede em que as células T, macrófagos, mastócitos e células dendríticas infiltrar o endotélio em acumulam de sangue, eventualmente formando placas ateroscleróticas. Ateroma apresenta um lipido cristais de colesterol e núcleo, evidenciados por medições de ultra-sonografia de alta resolução B-modo da carótida íntima mídia espessura4,5. Em macrófagos, efluxo de colesterol para partículas de lipídios aceitador é realizado por meio de receptores ATP-binding cassette (ABC) ABCA1, membro do ATP subfamília G 1 (ABCG1) e o receptor ao tesouro SR-BI. O desequilíbrio do colesterol influxo e efluxo em macrófagos é considerado um processo chave na aterosclerose iniciação6. Efluxo de colesterol é considerado um passo fundamental na eliminação de colesterol dos tecidos periféricos para o plasma e fígado em um processo chamado transporte reverso de colesterol (RCT). Colesterol é transferida de macrófagos principalmente para Apolipoproteína A1 (ApoA1) encontrados na superfície das partículas de lipoproteína de alta densidade (HDL). HDLs então transportam de colesterol para o fígado para excreção e reutilização de8,7,9.
Tradicionalmente, o colesterol de rádio-rotulados de trítio (3H) tem sido usado no efluxo de colesterol10. O sinal de emissão de radioisótopos é altamente sensível,10; no entanto, colesterol marcado apresenta limitações óbvias, tais como protocolos longos, risco de exposição a radiações ionizantes e a necessidade especial de radioactividade instalações e equipamentos garantir a manipulação segura de emissão radioactiva. Pelo contrário, fluorescência tenha sido incorporada com sucesso em técnicas de diagnóstico, devido à sua simplicidade na detecção do sinal fluorescente, a grande variedade de fluorophores disponível e sua segurança11. Vários esteróis com rótulo fluorescentes têm sido usados para estudar o metabolismo do colesterol incluindo dehydroergosterol (com fluorescência intrínseca), dansyl colesterol, 4,4-diflúor-3a, 4adiaza-s-indacene (BODIPY) – colesterol e 22-(N-(7- Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-YL)amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-ol (NBD-colesterol). Particularmente, NBD-colesterol apresenta uma absorção eficiente em células humanas12. Dois diferentes NBD rotulados-colesterol estão atualmente disponíveis: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) e 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-NBD; A Figura 1). Colesterol rotulado com moiety 22-NBD pode melhor se adequar estudos de efluxo de colesterol, enquanto 25-NBD-colesterol é usado principalmente na membrana celular dinâmica pesquisa13,14.
Linhas de células normalmente utilizadas em ensaios de efluxo de colesterol in vitro são monócitos células como as células THP-1 derivado de leucemia humanas, murino Raw 264.7 células15ou J774.1. Todas essas células podem ser diferenciadas em macrófagos em vitro usando phorbol myristate 12 13-acetato (PMA), mas THP 1-derivado de macrófagos (dmTHP-1) melhores refletem e imitam os macrófagos humanos16.
No presente estudo, podemos otimizar e padronizar um método de alta produtividade fluorescente para determinar a capacidade de efluxo do colesterol das amostras de soro na dmTHP-1, usando 22-NBD-colesterol como uma alternativa para [3H]-colesterol. Além disso, comparamos a técnica fluorescente otimizada com o padrão analógico radioativo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Colesterol com rótulo fluorescente é uma estratégia promissora para analisar e investigar as propriedades e o metabolismo do colesterol natural in vitro. Suas principais vantagens são que ele pode ser absorvido por células, permite para intracelular e estudos de distribuição de membrana e pode ser aplicado a ensaios de efluxo colesterol como no presente protocolo (Figura 7). Alguns esteróis fluorescente-rotulados permitam colesterol rastreamento in-vitro incluindo BODIPY-colesterol, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi parcialmente apoiado pela pesquisa concede FIS (PS12/00866) do Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Espanha; Fondo Europeo el de pará Desarrollo Regional (FEDER); Red de Investigación en SIDA (RIS), ISCIII-relíquia (RD16/0025/0002) e programa de CERCA / Generalitat de Catalunya. Os autores graças a Retrovirology e o laboratório de Imunopatologia Viral do d’Investigacions Institut Biomèdiques agosto Pi I Sunyer (IDIBAPS). Agradecemos T. Escribà, c. Rovira e Hurtado C. por sua assistência e S. Cufí do escritório de transferência de tecnologia e conhecimento para sua orientação em proteger a invenção.
Materials
| 96-well collecting plate | Corning Inc | Costar 3912 | white 96-well plate with opaque clear bottom |
| 96-well culture plate | Corning Inc | Costar 3610 | white 96-well plate with flat clear bottom |
| Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based) | Abcam | ab196985 | commercial high-throughput cell-based assay kit aimed to determine the cholesterol efflux |
| colorless RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R7509 | RPMI 1640 with no pehnol-red |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Version 2.0 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790-100G | Glycine, non-animal use |
| Luminometer | Biotek | SYNERGY HT | Multi-Detection Microplate Reader |
| Lysis Solution 1 | in-house | 50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl and H2O | |
| Lysis Solution 2 | in-house | Pure ethanol and Cell Lysis Solution 1:1 (v:v) | |
| NBD-cholesterol | Thermo-Fisher | N1148 | 22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Phosphate-buffered saline |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 202452-250G | polyethylene glycol |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | Phorbol 12-merystate B-acetate. |
| R10 | in-house | RPMI 1640 supplemented with 10 % fetal bovine serum and 5 % Penicillin/Streptomycin. | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | RPMI 1640 with 2mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose |
| THP-1 cells | Sigma-Aldrich | ATCC, #TIB-202 | monocyte-like line derived from leukemia from a one year old baby |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 |
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