Ensayo de eflujo de colesterol marcado con Nitrobenzoxadiazole de alto rendimiento
Summary
Medición de la capacidad de eflujo de colesterol in vitro en suero o plasma en modelos celulares de macrófagos es una herramienta prometedora como un biomarcador para la ateroesclerosis. En el presente estudio, optimizar y estandarizar un método fluorescente de eflujo de NBD-colesterol y desarrollar un análisis de alto rendimiento con placas de 96 pocillos.
Abstract
Atherosclerosis conduce a enfermedades cardiovasculares (ECV). No está todavía claro si la concentración de colesterol-HDL (cHDL) desempeña un papel causal en el desarrollo de aterosclerosis. Sin embargo, un factor importante en las primeras etapas de formación de la placa de ateroma es capacidad de eflujo de colesterol de HDL (la capacidad de las partículas de HDL colesterol de los macrófagos de aceptar) para evitar formación de espuma de la célula. Este es un paso clave para evitar la acumulación de colesterol en el endotelio y una parte del transporte de colesterol inverso (ECA) para eliminar el colesterol por el hígado. Capacidad de eflujo de colesterol en suero o plasma en modelos celulares de macrófagos es una herramienta prometedora que puede utilizarse como marcador de aterosclerosis. Tradicionalmente, [3H]-colesterol se ha utilizado en ensayos de eflujo de colesterol. En este estudio, nuestro objetivo es desarrollar una estrategia más segura y más rápida con fluorescente etiquetado-colesterol (colesterol de NBD) en un ensayo celular rastrear el proceso de absorción y eflujo de colesterol en macrófagos THP-1-derivados. Por último, optimizar y estandarizar el método de eflujo de NBD-colesterol y desarrollar un análisis de alto rendimiento con placas de 96 pocillos.
Introduction
Según la Organización Mundial de la salud, las principales causas actuales de muerte en todo el mundo son la cardiopatía isquémica y accidente cerebrovascular (que representa un total de 15,2 millones de defunciones)1. Ambos son las enfermedades cardiovasculares (ECV) que pueden estar precedidas por la aterosclerosis y la ruptura de placas de ateroma en los vasos sanguíneos2,3.
Aterosclerosis es una enfermedad inflamatoria del pared vaso en el que los macrófagos, células T, mastocitos y células dendríticas infiltran en el endotelio y acumulan de la sangre, eventualmente formando placas ateroscleróticas. Placas ateroscleróticas presentan un lípido cristales base y colesterol, por medidas de ecografía de alta resolución B-modo de la carótida íntima media grueso4,5. En macrófagos, eflujo de colesterol hacia las partículas de aceptador de lípidos se realiza por medio de los ATP-binding cassette (ABC) los receptores ABCA1, miembro de ATP enlace cassette subfamilia G 1 (ABCG1) y el receptor scavenger SR-BI. El desequilibrio del flujo de colesterol y de la emanación en los macrófagos se considera un proceso clave en la aterosclerosis iniciación6. Eflujo de colesterol se considera un paso clave en la eliminación de colesterol del tejido periférico para el plasma y el hígado en un proceso llamado transporte de colesterol inverso (ECA). Se transfiere colesterol de los macrófagos principalmente a apolipoproteína A1 (ApoA1) encontrados en la superficie de las partículas de lipoproteína de alta densidad (HDL). Esferoides entonces transportan colesterol al hígado para la excreción y reutilización7,8,9.
Colesterol marcado con radio de tritio (3H) se ha utilizado tradicionalmente, en el eflujo de colesterol10. La señal de emisión de radioisótopos es altamente sensible10; sin embargo, colesterol marcado con radio presenta desventajas obvias como protocolos largos, el riesgo de exposición a la radiación ionizante y la necesidad de radiactividad especial instalaciones y equipos para manejo de emisiones radiactivas. Por el contrario, la fluorescencia se ha incorporado con éxito en las técnicas de diagnóstico debido a su simplicidad en la detección de la señal fluorescente, la gran variedad de fluoróforos disponibles y su seguridad11. Varios esteroles fluorescentes etiquetados han sido utilizados para estudiar el metabolismo del colesterol como dehydroergosterol (con fluorescencia intrínseca), colesterol de Dansilo, 4,4-difluoro-3a, 4adiaza-s-indacene (BODIPY) – colesterol y 22-(N-(7- Nitrobenz-2-OXA-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-Bisnor-5-cholen-3β-ol (NBD-colesterol). Particularmente, NBD-colesterol presenta una absorción eficaz en células humanas12. Están disponibles dos diferentes NBD etiquetados-colesterol: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) y 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-NBD; Figura 1). Colesterol con parte de la 22-NBD puede satisfacer mejor estudios de eflujo de colesterol, mientras que 25 NBD de colesterol se utiliza principalmente en la membrana celular dinámica investigación13,14.
Líneas celulares típicamente utilizadas en los análisis de eflujo de colesterol in vitro son monocitos-como las células como las células THP-1 humanas derivada de la leucemia murino de células Raw 264.715y J774.1. Todas estas células pueden diferenciarse en macrófagos en vitro con forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) y macrófagos THP-1 derivados (dmTHP-1) mejor reflejan y mímico los macrófagos humanos16.
En el presente estudio, optimizar y estandarizar un método fluorescente de alto rendimiento para determinar la capacidad de eflujo de colesterol de las muestras de suero de dmTHP-1, con 22-NBD-colesterol como alternativa a [3H]-colesterol. Además, comparamos la técnica fluorescente optimizada con el estándar análogo radioactivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Etiqueta fluorescente el colesterol es una estrategia prometedora para analizar e investigar las propiedades y el metabolismo del colesterol natural in vitro. Sus principales ventajas son que puede ser tomada por las células, permite la intracelular y los estudios de distribución de la membrana y puede ser aplicado a ensayos de eflujo de colesterol como este protocolo (figura 7). Algunos esteroles etiquetados fluorescentes permiten seguimiento de colesterol in vitro incluyendo BODIPY-coles…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo ha sido parcialmente financiado por FIS (PS12/00866) las becas de la investigación del Instituto de Salud Carlos III, Madrid, España; El de Fondo Europeo para Desarrollo Regional (FEDER); Red de Investigación en SIDA (RIS), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) y el programa de CERCA / Generalitat de Catalunya. Los autores agradecen la Retrovirología y Viral laboratorio de Inmunopatología del Institut d ‘ Investigacions Biomèdiques de agosto Pi I Sunyer (IDIBAPS). Agradecemos a T. Escribà, C. Rovira y C. Hurtado por su asistencia y Cufí S. desde el conocimiento y la oficina de transferencia de tecnología para su orientación en la protección de la invención.
Materials
| 96-well collecting plate | Corning Inc | Costar 3912 | white 96-well plate with opaque clear bottom |
| 96-well culture plate | Corning Inc | Costar 3610 | white 96-well plate with flat clear bottom |
| Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based) | Abcam | ab196985 | commercial high-throughput cell-based assay kit aimed to determine the cholesterol efflux |
| colorless RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R7509 | RPMI 1640 with no pehnol-red |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Version 2.0 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790-100G | Glycine, non-animal use |
| Luminometer | Biotek | SYNERGY HT | Multi-Detection Microplate Reader |
| Lysis Solution 1 | in-house | 50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl and H2O | |
| Lysis Solution 2 | in-house | Pure ethanol and Cell Lysis Solution 1:1 (v:v) | |
| NBD-cholesterol | Thermo-Fisher | N1148 | 22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Phosphate-buffered saline |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 202452-250G | polyethylene glycol |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | Phorbol 12-merystate B-acetate. |
| R10 | in-house | RPMI 1640 supplemented with 10 % fetal bovine serum and 5 % Penicillin/Streptomycin. | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | RPMI 1640 with 2mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose |
| THP-1 cells | Sigma-Aldrich | ATCC, #TIB-202 | monocyte-like line derived from leukemia from a one year old baby |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 |
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