Yüksek işlem hacmi Nitrobenzoxadiazole etiketli kolesterol sızma tahlil
Summary
Tüp bebek kolesterol sızma kapasitesi serum veya plazma makrofaj hücre modelleri için gelecek vaat eden bir araç olarak bir biyomarker ateroskleroz için ölçümdür. Bu da çalışmanın, biz optimize etmek ve bir floresan NBD-kolesterol sızma yöntemi standartlaştırmak ve 96-şey plakaları kullanarak yüksek üretilen iş çözümlemesi geliştir.
Abstract
Ateroskleroz kardiyovasküler hastalık (CVD) yol açar. Hala belirsiz olup kolesterol HDL (cHDL) konsantrasyon ateroskleroz gelişmede nedensel bir rol oynar. Ancak, önemli bir aterom plak oluşumu, erken evrelerinde kolesterol sızma kapasitesi HDL (makrofajlar kolesterolden kabul etme yeteneği HDL parçacıkların) için faktördür köpük hücre oluşumunu önlemek için. Bu endotel ve ters kolesterol taşıma (RCT) kolesterol karaciğer yoluyla ortadan kaldırmak için bir parçası kolesterol birikimi kaçınmak önemli bir adımdır. Kolesterol sızma kapasitesi serum veya plazma makrofaj hücre modelleri biyomarker ateroskleroz için kullanılabilir gelecek vaat eden bir araçtır. Geleneksel olarak, [3H]-kolesterol kolesterol sızma deneyleri içinde kullanılır. Bu çalışmada, floresan etiketli-kolesterol (NBD-kolesterol) kullanarak daha güvenli ve daha hızlı bir strateji geliştirmek için THP 1 türetilmiş makrofajlar kolesterol alımı ve sızma sürecinde izlemek için hücresel bir tahlil amacımız. Son olarak, biz optimize etmek ve NBD-kolesterol sızma yöntemi standartlaştırmak ve 96-şey plakaları kullanarak yüksek üretilen iş çözümlemesi geliştir.
Introduction
Dünya Sağlık Örgütü göre iskemik kalp hastalığı ve inme (muhasebe 15.2 milyon ölüm olmak üzere toplam)1ölüm dünya çapında geçerli asıl nedenleri vardır. Ateroskleroz ve kan damarları2,3‘ te aterom plak yırtılması tarafından öncesinde kardiyovasküler hastalık (CVD) ikisi de.
Ateroskleroz makrofajlar, T hücreleri, mast hücreleri ve dendritik hücreler endotel sızmak ve sonunda aterosklerotik plaklar oluşturan kan birikir bir gemi Duvar iltihabi bir hastalıktır. Aterosklerotik plaklar çekirdek ve kolesterol kristalleri, yüksek çözünürlüklü B-mod ultrasonografi ölçümleri karotis intima media kalınlığı4,5tarafından kanıtlanan bir lipid mevcut. Makrofajlar, kolesterol sızma lipid alıcısı parçacıklar doğru ve çöpçü reseptör SR-BI aracı ATP-bağlayıcı kaset (ABC) reseptörleri ABCA1, ATP bağlama kaset Alt familya G üye 1 (ABCG1) tarafından yapılır. Kolesterol akını ve sızma makrofajlar içinde dengesizlik ateroskleroz başlatma6anahtar bir süreç olarak kabul edilir. Kolesterol sızma periferik doku için plazma kolesterol eleme önemli bir adım ve karaciğer ters kolesterol taşıma (RCT) denen bir süreç olarak kabul edilir. Kolesterol yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL) parçacıklar yüzeyinde bulunan makrofajlar ağırlıklı olarak apolipoprotein A1 (ApoA1) üzerinden aktarılır. HDL kolesterol karaciğere atılımı ve yeniden kullanımı7,8,9sonra taşıma.
Geleneksel olarak, trityum (3H) radyo etiketli kolesterol kolesterol sızma10dakika sonra kullanılmıştır. Radioisotopes emisyon sinyalinin son derece hassas10‘ dur; Ancak, radyo etiketli kolesterol uzun iletişim kuralları, iyonizan radyasyona maruz kalma riski ve özel radyoaktivite tesisler ve ekipman radyoaktif emisyon güvenli kullanımı sağlamak için ihtiyaç gibi bariz handikapları sunar. Aksine, floresans başarıyla sadeliği floresan sinyal algılama, fluorophores mevcut çok çeşitli ve emanet11nedeniyle tanı teknikleri dahil edilmiştir. Çeşitli floresan etiketli steroller kolesterol metabolizması (BODIPY) dehydroergosterol (ile içsel floresan), dansyl kolesterol, 4,4 üzerinden-difluoro-3a, 4adiaza-s-indacene de dahil olmak üzere eğitim için kullanılan – kolesterol ve 22-(N-(7- Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-ol (NBD-kolesterol). Özellikle, NBD-kolesterol verimli bir alımı insan hücreleri12‘ sunar. İki farklı NBD etiketli-kolesterol Şu anda kullanılabilir: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) ve 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-NBD; Şekil 1). 25-NBD-kolesterol hücresel zar dinamiği araştırma13,14‘ te ağırlıklı olarak kullanıldığı gibi kolesterol ile 22-NBD yan etiketli en iyi kolesterol sızma çalışmalar, uygun olmayabilir.
Hücre hatları genellikle tüp bebek kolesterol sızma deneyleri içinde kullanılan insan lösemi kaynaklı THP-1 hücreleri, fare ham 264.7 hücreleri15veya J774.1 gibi monosit benzeri hücrelerdir. Bu hücrelerin tümünü phorbol 12-myristate 13-asetat (PMA) kullanılarak in vitro makrofajlar içine farklılaşmış, ama makrofajlar (dmTHP-1) en iyi THP 1 türetilmiş yansıtmak ve insan makrofajlar16taklit.
Mevcut çalışmada, en iyi duruma getirme ve 22-NBD-kolesterol [3H] Alternatif olarak kullanarak serum numuneleri dmTHP-1, kolesterol sızma kapasitesini belirlemek için bir floresan yüksek üretilen iş yöntemi standartlaştırmak-kolesterol. Buna ek olarak, biz en iyi duruma getirilmiş floresan tekniği ile standart radyoaktif analog karşılaştırın.
Protocol
Representative Results
Discussion
Floresan etiketli kolesterol çözümlemek ve özellikleri ve metabolizma doğal kolesterol tüp bebek araştırmak için umut verici bir stratejidir. Başlıca avantajları vardır bu hücreleri tarafından alınabilir, hücre içi sağlar ve membran dağıtım çalışmaları ve kolesterol sızma deneyleri bu Protokolü (Şekil 7) olduğu gibi bu tür uygulanabilir. Bazı floresan etiketli steroller kolesterol izleme BODIPY-kolesterol, dansyl-kolesterol, dehydroegrosterol ve 22 – ve 25-NBD…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser kısmen tarafından desteklenen araştırma FIS (PS12/00866) Instituto de Salud Carlos III, Madrid, İspanya üzerinden; verir. Fondo Europeo para el Desarrollo bölgesel (FEDER); Red de Investigación en SIDA (RIS), ISCIII-sayımlı (RD16/0025/0002) ve eğer programı / Generalitat de Catalunya. Yazarlar Retrovirology ve Viral Immunopathology laboratuvar Institut d’Investigacions Biomèdiques Ağustos Pi I Sunyer (IDIBAPS) teşekkür ederiz. Biz T. Escribà, C. Rovira ve C. Hurtado onların yardım ve bilgi ve Teknoloji Transfer Ofisi S. Cufí korumak icat onun rehberlik için teşekkür ederiz.
Materials
| 96-well collecting plate | Corning Inc | Costar 3912 | white 96-well plate with opaque clear bottom |
| 96-well culture plate | Corning Inc | Costar 3610 | white 96-well plate with flat clear bottom |
| Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based) | Abcam | ab196985 | commercial high-throughput cell-based assay kit aimed to determine the cholesterol efflux |
| colorless RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R7509 | RPMI 1640 with no pehnol-red |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Version 2.0 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790-100G | Glycine, non-animal use |
| Luminometer | Biotek | SYNERGY HT | Multi-Detection Microplate Reader |
| Lysis Solution 1 | in-house | 50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl and H2O | |
| Lysis Solution 2 | in-house | Pure ethanol and Cell Lysis Solution 1:1 (v:v) | |
| NBD-cholesterol | Thermo-Fisher | N1148 | 22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Phosphate-buffered saline |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 202452-250G | polyethylene glycol |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | Phorbol 12-merystate B-acetate. |
| R10 | in-house | RPMI 1640 supplemented with 10 % fetal bovine serum and 5 % Penicillin/Streptomycin. | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | RPMI 1640 with 2mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose |
| THP-1 cells | Sigma-Aldrich | ATCC, #TIB-202 | monocyte-like line derived from leukemia from a one year old baby |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 |
References
- Hansson, G. K., Hermansson, A. The immune system in atherosclerosis. Nature Immunology. 12 (3), 204-212 (2011).
- Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature. 473 (7347), 317-325 (2011).
- Ilhan, F. Atherosclerosis and the role of immune cells. World Journal of Clinical Cases. 3 (4), 345 (2015).
- Greaves, D. R., Gordon, S. Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease. Trends Immunol. 22, (2001).
- Yamamoto, S., Narita, I., Kotani, K. The macrophage and its related cholesterol efflux as a HDL function index in atherosclerosis. Clinica Chimica Acta. 457, 117-122 (2016).
- Escolà-Gil, J. C., Rotllan, N., Julve, J., Blanco-Vaca, F. In vivo macrophage-specific RCT and antioxidant and antiinflammatory HDL activity measurements: New tools for predicting HDL atheroprotection. Atherosclerosis. 206 (2), 321-327 (2009).
- Santos-Gallego, C. G., Ibanez, B., Badimon, J. J. HDL-cholesterol: Is it really good? Differences between apoA-I and HDL. Biochemical Pharmacology. 76 (4), 443-452 (2008).
- Rothblat, G. H., Phillips, M. C. High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport. Current Opinion in Lipidology. 21 (3), 229-238 (2010).
- Hafiane, A., Genest, J. HDL-mediated cellular cholesterol efflux assay method. Annals of Clinical and Laboratory Science. 45 (6), 659-668 (2015).
- Szalaia, R., Hadzsiev, K., Melegh, B. Cytochrome P450 Drug Metabolizing Enzymes in Roma Population Samples: Systematic Review of the Literature. Current Medicinal Chemistry. 23, 1-26 (2016).
- Mcintosh, A. L., et al. Fluorescent Sterols for the Study of Cholesterol Trafficking in Living Cells. Probes and Tags to Study Biomolecular Function: for Proteins, RNA, and Membranes. , 1-33 (2008).
- Ostašov, P., et al. FLIM studies of 22- and 25-NBD-cholesterol in living HEK293 cells: Plasma membrane change induced by cholesterol depletion. Chemistry and Physics of Lipids. 167, 62-69 (2013).
- Song, W., et al. Characterization of fluorescent NBD-cholesterol efflux in THP-1-derived macrophages. Molecular Medicine Reports. 12 (4), 5989-5996 (2015).
- Liu, N., Wu, C., Sun, L., Zheng, J., Guo, P. Sesamin enhances cholesterol efflux in RAW264.7 macrophages. Molecules. 19 (6), 7516-7527 (2014).
- Qin, Z. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis. 221 (1), 2-11 (2012).
- Low, H., Hoang, A., Sviridov, D. Cholesterol Efflux Assay. Journal of Visualized Experiments. (61), 5-9 (2012).
- Gimpl, G., Gehrig-Burger, K. Cholesterol reporter molecules. Bioscience Reports. 27 (6), 335-358 (2007).
- Zhang, J., Cai, S., Peterson, B. R., Kris-Etherton, P. M., Heuvel, J. P. Vanden Development of a Cell-Based, High-Throughput Screening Assay for Cholesterol Efflux Using a Fluorescent Mimic of Cholesterol. ASSAY and Drug Development Technologies. 9 (2), 136-146 (2011).
- Rader, D. D. J. Molecular regulation of HDL metabolism and function: implications for novel therapies. Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3090-3100 (2006).
- Davidson, W. S., et al. The effects of apolipoprotein B depletion on HDL subspecies composition and function. Journal of Lipid Research. 57 (4), 674-686 (2016).
- Park, S. H., et al. Sage weed (Salvia plebeia) extract antagonizes foam cell formation and promotes cholesterol efflux in murine macrophages. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1105-1112 (2012).
- Litvinov, Y., Savushkin, E. V., Garaeva, E. A. D. A. Cholesterol Efflux and Reverse Cholesterol Transport: Experimental Approaches. Current Medicinal Chemistry. 371 (25), 2383-2393 (2016).
- Phillips, A., Mucksavage, M. L., Wilensky, R. L., Mohler, E. R. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364 (2), 127-135 (2011).
- Rohatgi, A., et al. HDL Cholesterol Efflux Capacity and Incident Cardiovascular Events. New England Journal of Medicine. 371 (25), 2383-2393 (2014).
