Høy gjennomstrømming Nitrobenzoxadiazole-merket kolesterol middelklasseinnbyggere analysen
Summary
Måling av i vitro kolesterol middelklasseinnbyggere serum- eller macrophage celle modeller er et lovende verktøy som en biomarkør for aterosklerose. Studien, vi optimalisere og standardisere fluorescerende NBD-kolesterol middelklasseinnbyggere metode og utvikle en høy gjennomstrømming analyse bruker 96-brønns plater.
Abstract
Aterosklerose fører til hjerte-og karsykdommer (CVD). Det er fortsatt uklart om kolesterol-HDL (cHDL) konsentrasjon spiller en årsakssammenheng rolle i aterosklerose utvikling. En viktig faktor i tidlige stadier av atheroma plakk formasjon er imidlertid kolesterol middelklasseinnbyggere kapasitet til HDL (muligheten til HDL partikler godta kolesterol fra makrofager) for å unngå skum celle formasjon. Dette er et viktig skritt unngå akkumulering av kolesterol i endotelet og en del av omvendt kolesterol transport (RCT) for å eliminere kolesterol gjennom leveren. Kolesterol middelklasseinnbyggere kapasitet til serum- eller macrophage celle modeller er et lovende verktøy som kan brukes som biomarkør for aterosklerose. Tradisjonelt [3H]-kolesterol er brukt i kolesterol middelklasseinnbyggere analyser. I denne studien ønsker vi å utvikle en tryggere og raskere strategi med fluorescerende merket-kolesterol (NBD-kolesterol) i en mobilnettet analysen å spore kolesterol opptak og middelklasseinnbyggere prosessen THP-1-derivert makrofager. Til slutt, vi optimalisere og standardisere NBD-kolesterol middelklasseinnbyggere metoden og utvikle en høy gjennomstrømming analyse bruker 96-brønns plater.
Introduction
Ifølge Verdens helseorganisasjon er de gjeldende viktigste årsakene til dødsfall verdensomspennende iskemisk hjertesykdom og hjerneslag (Regnskapsførsel for totalt 15,2 millioner dødsfall)1. Begge er karsykdommer (CVD) som kan innledes med åreforkalkning og brudd på plaketter av atheroma i blodårene2,3.
Atherosclerosis er et fartøyet veggen inflammatorisk sykdom som makrofager, T-celler, mastceller og dendrittiske celler infiltrere endotelet og akkumuleres fra blod, til slutt danne aterosklerotisk plaketter. Aterosklerotisk plaketter presentere en lipid kjernen og kolesterol krystaller, dokumentert av høyoppløselige B-modus ultrasonography målinger av carotis intima media tykkelse4,5. I makrofager utføres kolesterol middelklasseinnbyggere mot lipid acceptor partikler av ATP-bindende kassett (ABC) receptors ABCA1, ATP bindende kassett gruppe G medlem 1 (ABCG1), og scavenger receptor SR-BI. Ubalansen av kolesterol tilstrømningen og middelklasseinnbyggere i makrofager er ansett som en viktig prosess i aterosklerose innvielsen6. Kolesterol middelklasseinnbyggere er ansett som et viktig skritt i kolesterol eliminering fra perifere vev plasma og lever i en prosess som kalles omvendt kolesterol transport (RCT). Kolesterol overføres fra makrofager hovedsakelig til apolipoprotein A1 (ApoA1) på overflaten av high-density lipoprotein (HDL) partikler. Deretter transportere HDL kolesterol til leveren for utskillelse og re utnyttelse7,8,9.
Tritium (3H) radio-merket kolesterol er tradisjonelt brukt i kolesterol middelklasseinnbyggere10. Utslipp signalet fra radioisotopes er svært følsom10; imidlertid presenterer radio-merket kolesterol åpenbare handikap som lang protokoller, risiko for eksponering for ioniserende stråling og behovet for spesiell radioaktivitet lokaler og utstyr å sikre trygg håndtering av radioaktivt utslipp. Tvert imot, vært fluorescens vellykket innarbeidet i diagnostiske teknikker på grunn av sin enkelhet i fluorescerende signalgjenkjenning, rekke fluorophores tilgjengelige og dens sikkerhet11. Flere fluorescerende-merket steroler har blitt brukt til å studere kolesterol metabolisme inkludert dehydroergosterol (med iboende fluorescens), dansyl kolesterol, 4,4-difluoro-3a, 4adiaza-s-indacene (BODIPY) – kolesterol og 22-(N-(7- Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-YL)amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-OL (NBD-kolesterol). Spesielt, presenterer NBD-kolesterol en effektiv opptak i menneskelige celler12. To forskjellige NBD merket-kolesterol er tilgjengelige: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) og 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-NBD; Figur 1). Kolesterol merket med 22-NBD moiety kan best passer kolesterol middelklasseinnbyggere studier, mens 25-NBD-kolesterol brukes hovedsakelig i mobilnettet membran dynamics research13,14.
Cellelinjer vanligvis brukes i i vitro kolesterol middelklasseinnbyggere analyser er monocytt-lignende celler som menneskelige leukemi-avledet THP-1 celler, murine rå 264.7 celler15eller J774.1. Alle disse cellene kan differensieres i makrofager i vitro bruker phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), men THP-1-derivert makrofager (dmTHP-1) beste reflektere og etterligne menneskelige makrofager16.
Studien, vi optimalisere og standardisere fluorescerende høy gjennomstrømming metode for å fastslå kolesterol middelklasseinnbyggere kapasitet serumprøver på dmTHP-1, med 22-NBD-kolesterol som et alternativ til [3H]-kolesterol. I tillegg sammenligne vi optimalisert fluorescerende teknikken med standard radioaktivt analog.
Protocol
Representative Results
Discussion
Merket med fluorescerende kolesterol er en lovende strategi for å analysere og undersøke egenskapene og metabolisme av naturlige kolesterol i vitro. De viktigste fordelene er at det kan tas av celler, tillater intracellulær og membran distribusjon studier, og kan brukes på kolesterol middelklasseinnbyggere analyser som denne protokollen (figur 7). Noen fluorescerende-merket steroler tillate kolesterol sporing i vitro inkludert BODIPY-kolesterol, dansyl-kolesterol, dehydroegrosterol og 22…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet har vært delvis støttet av forskning gir FIS (PS12/00866) fra Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spania. Fondo Europeo para el Desarrollo Regional (FEDER); Red de Investigación en SIDA (RIS), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) og søk etter program / Generalitat de Catalunya. Forfatterne takke Retrovirology og Viral Immunopathology laboratorium av Institut d’Investigacions Biomèdiques August Pi I Sunyer (IDIBAPS). Vi takker T. Escribà, C. Rovira og C. Hurtado for deres hjelp og S. Cufí fra kunnskap og teknologi overføre Office for sin veiledning i å beskytte oppfinnelsen.
Materials
| 96-well collecting plate | Corning Inc | Costar 3912 | white 96-well plate with opaque clear bottom |
| 96-well culture plate | Corning Inc | Costar 3610 | white 96-well plate with flat clear bottom |
| Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based) | Abcam | ab196985 | commercial high-throughput cell-based assay kit aimed to determine the cholesterol efflux |
| colorless RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R7509 | RPMI 1640 with no pehnol-red |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Version 2.0 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790-100G | Glycine, non-animal use |
| Luminometer | Biotek | SYNERGY HT | Multi-Detection Microplate Reader |
| Lysis Solution 1 | in-house | 50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl and H2O | |
| Lysis Solution 2 | in-house | Pure ethanol and Cell Lysis Solution 1:1 (v:v) | |
| NBD-cholesterol | Thermo-Fisher | N1148 | 22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Phosphate-buffered saline |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 202452-250G | polyethylene glycol |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | Phorbol 12-merystate B-acetate. |
| R10 | in-house | RPMI 1640 supplemented with 10 % fetal bovine serum and 5 % Penicillin/Streptomycin. | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | RPMI 1640 with 2mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose |
| THP-1 cells | Sigma-Aldrich | ATCC, #TIB-202 | monocyte-like line derived from leukemia from a one year old baby |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 |
References
- Hansson, G. K., Hermansson, A. The immune system in atherosclerosis. Nature Immunology. 12 (3), 204-212 (2011).
- Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature. 473 (7347), 317-325 (2011).
- Ilhan, F. Atherosclerosis and the role of immune cells. World Journal of Clinical Cases. 3 (4), 345 (2015).
- Greaves, D. R., Gordon, S. Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease. Trends Immunol. 22, (2001).
- Yamamoto, S., Narita, I., Kotani, K. The macrophage and its related cholesterol efflux as a HDL function index in atherosclerosis. Clinica Chimica Acta. 457, 117-122 (2016).
- Escolà-Gil, J. C., Rotllan, N., Julve, J., Blanco-Vaca, F. In vivo macrophage-specific RCT and antioxidant and antiinflammatory HDL activity measurements: New tools for predicting HDL atheroprotection. Atherosclerosis. 206 (2), 321-327 (2009).
- Santos-Gallego, C. G., Ibanez, B., Badimon, J. J. HDL-cholesterol: Is it really good? Differences between apoA-I and HDL. Biochemical Pharmacology. 76 (4), 443-452 (2008).
- Rothblat, G. H., Phillips, M. C. High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport. Current Opinion in Lipidology. 21 (3), 229-238 (2010).
- Hafiane, A., Genest, J. HDL-mediated cellular cholesterol efflux assay method. Annals of Clinical and Laboratory Science. 45 (6), 659-668 (2015).
- Szalaia, R., Hadzsiev, K., Melegh, B. Cytochrome P450 Drug Metabolizing Enzymes in Roma Population Samples: Systematic Review of the Literature. Current Medicinal Chemistry. 23, 1-26 (2016).
- Mcintosh, A. L., et al. Fluorescent Sterols for the Study of Cholesterol Trafficking in Living Cells. Probes and Tags to Study Biomolecular Function: for Proteins, RNA, and Membranes. , 1-33 (2008).
- Ostašov, P., et al. FLIM studies of 22- and 25-NBD-cholesterol in living HEK293 cells: Plasma membrane change induced by cholesterol depletion. Chemistry and Physics of Lipids. 167, 62-69 (2013).
- Song, W., et al. Characterization of fluorescent NBD-cholesterol efflux in THP-1-derived macrophages. Molecular Medicine Reports. 12 (4), 5989-5996 (2015).
- Liu, N., Wu, C., Sun, L., Zheng, J., Guo, P. Sesamin enhances cholesterol efflux in RAW264.7 macrophages. Molecules. 19 (6), 7516-7527 (2014).
- Qin, Z. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis. 221 (1), 2-11 (2012).
- Low, H., Hoang, A., Sviridov, D. Cholesterol Efflux Assay. Journal of Visualized Experiments. (61), 5-9 (2012).
- Gimpl, G., Gehrig-Burger, K. Cholesterol reporter molecules. Bioscience Reports. 27 (6), 335-358 (2007).
- Zhang, J., Cai, S., Peterson, B. R., Kris-Etherton, P. M., Heuvel, J. P. Vanden Development of a Cell-Based, High-Throughput Screening Assay for Cholesterol Efflux Using a Fluorescent Mimic of Cholesterol. ASSAY and Drug Development Technologies. 9 (2), 136-146 (2011).
- Rader, D. D. J. Molecular regulation of HDL metabolism and function: implications for novel therapies. Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3090-3100 (2006).
- Davidson, W. S., et al. The effects of apolipoprotein B depletion on HDL subspecies composition and function. Journal of Lipid Research. 57 (4), 674-686 (2016).
- Park, S. H., et al. Sage weed (Salvia plebeia) extract antagonizes foam cell formation and promotes cholesterol efflux in murine macrophages. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1105-1112 (2012).
- Litvinov, Y., Savushkin, E. V., Garaeva, E. A. D. A. Cholesterol Efflux and Reverse Cholesterol Transport: Experimental Approaches. Current Medicinal Chemistry. 371 (25), 2383-2393 (2016).
- Phillips, A., Mucksavage, M. L., Wilensky, R. L., Mohler, E. R. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364 (2), 127-135 (2011).
- Rohatgi, A., et al. HDL Cholesterol Efflux Capacity and Incident Cardiovascular Events. New England Journal of Medicine. 371 (25), 2383-2393 (2014).
