Vi præsenterer en fluorogenic peptid kavalergang assay, der giver mulighed for en hurtig screening af proteaser proteolytiske aktivitet på peptider der repræsenterer webstedet spaltning af viral fusion peptider. Denne metode kan også bruges på andre aminosyre motiv i en protein sekvens til at teste for protease aktivitet.
Kappebærende virus som coronavirus eller influenza virus kræver proteolytiske kløvningen af deres fusion protein til at være i stand til at inficere cellen vært. Viruser udstille celle og væv tropisme og er tilpasset til bestemte celler eller væv proteaser. Disse vira kan desuden indføre mutationer eller indrykninger i deres genom under replikering, der kan påvirke kavalergang, og dermed kan bidrage til tilpasninger til en ny vært. Vi præsenterer her, et fluorogenic peptid kavalergang assay, der giver mulighed for en hurtig screening af peptider efterligne webstedet spaltning af viral fusion proteiner. Teknikken er meget fleksibel og kan bruges til at undersøge de proteolytiske aktivitet af en enkelt protease på mange forskellige underlag, og derudover giver det også udforskning af aktiviteten af flere proteaser på én eller flere peptid substrater. I denne undersøgelse brugte vi peptider efterligne kavalergang site motiver af coronavirus spike protein. Vi har testet menneskelige og camel afledt Mellemøsten luftvejssyndrom coronavirus (MERS-CoV) påvise, enkelt og dobbelt udskiftninger på webstedet til spaltning kan ændre aktiviteten af furin og dramatisk ændre kavalergang effektivitet. Vi brugte også denne metode i kombination med Bioinformatik at teste furin kavalergang aktivitet af feline coronavirus spike proteiner fra forskellige serotyper og stammer. Dette peptid-baseret metode er mindre arbejdskraft- og tiden intensivt end konventionelle metoder til analyse af proteolytiske aktivitet for vira, og resultater kan opnås inden for en enkelt dag.
Viral fusion med værten cellemembranen er et afgørende skridt i livscyklus af kappebærende virus og letter indtastning ind i cellen og replikering af virus. Typisk besidder virus en specialiseret protein (eller proteiner), der binder sig til receptorer på cellemembranen vært og udløser virus-celle membran fusion1. Viral fusion proteiner har været inddelt i tre vigtigste klasser (I-III)1. En række af vira, der er i øjeblikket et stort problem for folkesundheden, såsom influenzavirus (der repræsenterer en mangeårig zoonotiske fremkomst fra fugle) og Mellemøsten respiratorisk syndrom-coronavirus (MERS-CoV) (der repræsenterer en nylig zoonotiske udmeldelse af kameler), udnytte den såkaldte klasse i fusion proteiner, som kræver proteolytiske behandling af vært proteaser, at udøve deres fusogenic aktivitet2. På samme måde, feline coronavirus (FCoV), som repræsenterer en større sygdomme trussel for vilde og indenlandske katte, også besidder en klasse jeg fusion protein. Klasse I viral fusion proteiner er typisk syntetiseres som en uncleaved forløber, og består som regel af to domæner, der er ansvarlige for receptor binding og udløser hændelsen fusion henholdsvis. Til dato, er influenza hemagglutinin (HA) bedst forstået fusion protein og talrige undersøgelser har beskrevet sit mekanistiske rolle i vært celle løsning og fusion3. I dette tilfælde opstår kavalergang fusion protein på en bestemt sekvens eller kavalergang websted inden for HA, og i kombination med pH-afhængige konformationelle ændringer, resulterer i eksponeringen af viral fusion peptid1,2.
Fusion peptid og dens foregående protease anerkendelse sekvens er kritisk for patogenicitet og vært tilpasning af virus. Ændringer i protease anerkendelse sekvens kan ændre kavalergang betydeligt med potentielt dramatiske konsekvenser for virus og vært4. På den ene side kan ophæve kavalergang og dermed fjerne virus livscyklus. Men på den anden side en mutation kan øge substrat specificitet for en given protease og/eller give mulighed for en “ny” protease at kløve fusion protein. Efterfølgende, kan dette også udvide den celle og væv tropisme som observeret, fx med influenza-virus subtype5,6. Lav normalt sygdomsfremkaldende evne aviær influenza (LPAI) virus og mest humane influenzavirus er begrænset til mave-tarm- eller luftvejsinfektioner tarmkanalen på grund af den begrænsede lokalisering af proteaser, der aktiverer dem. Typisk, fusion peptid af sådanne HA proteiner er efterfulgt af en fire-amino syre sekvens, der består af 1-2 ikke-fortløbende grundlæggende aminosyrer, som er anerkendt af trypsin-lignende Serin proteaser som trypsin, matriptase eller TMPRSS27, 8. Når virussen erhverver indrykninger eller mutationer, der ændrer kavalergang websted til en flerbasiske websted, det tillader furin at aktivere HA og potentielt forårsage en langt mere alvorlig systemisk infektion6,9. Disse vira er benævnt høj sygdomsfremkaldende evne aviær influenzavirus (HPAI), karakteriseret ved H5N1 stammer.
I modsætning til influenza HA har mange coronavirus, såsom MERS-CoV, to særskilte kavalergang websteder inden for deres spike protein. Webstedet S1/S2 adskiller den N-terminale receptor bindende domæne (S1) fra C-terminal fusion domæne (S2), med en anden kavalergang site, kaldet S2′, neden for webstedet S1/S2 i nærhed til fusion peptid10. Det blev foreslået, at steder er kløvet sekventielt, på S1/S2 efterfulgt af S2′. I modsætning til de fleste influenza-virusstammer, MERS-CoV S protein S1/S2 og S2 HA’ websteder kan blive genkendt af proteaser af familien proprotein convertase (PC), som furin. Medlemmer af denne familie kløver på parret grundlæggende rester med motiv R/K-(X)0,2,4,6-R/K(X, any amino acid)2. Generelt, aminosyrer opstrøms af webstedet kavalergang omtales som P1, P2 og P3. optælling fra webstedet kavalergang og aminosyrer nedstrøms er udpeget som P1′, P2′, P3′, osv. 11. FCoV stammer kan enten have en enkelt eller dobbelt kavalergang-websted. Ligesom MERS-CoV, nogle FCoV stammer også besidder to kavalergang websteder (S1/S2 og S2′) i deres S protein. Men denne egenskab er serotype jeg FCoVs (clade A). Derimod medlemmer af serotype II (clade B) gruppering kun har en enkelt kavalergang websted (S2′)2,12. Flere proteaser er blevet foreslået for at kløve FCoV kavalergang websteder, herunder furin, trypsin-lignende proteaser og cathepsin. Det er blevet foreslået, at S-protein på enteriske FCoV (også kendt som felin enterisk coronavirus eller FECV) er tilbøjelige til at være kløvet af furin på webstedet til S1/S2 og mutationer i dette websted (såvel som på S2′) fører til ændringer i protease krav. Disse mutationer har været forbundet med ændringer i tropisme og sygdomsfremkaldende egenskaber af disse vira, så virus bliver systemisk og makrofag-tropic (også kendt som felin infektiøs peritonitis virus eller FIPV)13.
Virus naturligvis indføre mutationer i deres genomer under hver replikering cyklus og ofte nye undertyper og stammer af influenza, MERS-CoV og FCoV er beskrevet14,15,16. Som en del af en hurtig evaluering for at vurdere trussel mod folkesundheden af nye virus, er det kritisk at undersøge ændringer i webstedet kavalergang og hvordan det påvirker vifte af proteaser aktivering disse vira. Her, vi beskriver et peptid-baseret analyse, der giver mulighed for en meget hurtig vurdering af, hvordan kavalergang site ændringer i MERS-CoV S protein påvirke substrat specificitet af en given protease og hurtigt skærm forskellige proteaser for deres evne til at kløve en given eller flere sekvenser4. I et andet sæt af forsøg brugte vi teknikken til at bestemme furin kavalergang aktivitet over forskellige FCoV serotyper og stammer.
Peptider bruges i denne analyse er ændret med fluorescens resonans energi overførsel (FRET) par, 7-methoxycoumarin-4-yl acetyl (MCA) på N-terminus og N-2,4-dinitrophenyl (DNP) på C-terminus. Under analysen, MCA er ophidset og udsender lys energi, som er slukket af DNP, som parret er i tæt nærhed til hinanden. Hvis spaltning opstår, men DNP er ikke i stand til at slukke emission længere og den kan læses af fluorescens-Pladelæser. Ændringer i Fluorescens er målt under forsøget at bestemme peptid kavalergang sats, og til at beregne den hastighed, hvormed protease kløver specifikke peptid (også kendt som Vmax)17.
For at udforme peptider, gen respektive fusion protein skal har blevet sekventeret og/eller stilles til rådighed i en database. Metoden er imidlertid mindre arbejdskraft-intens og dyre end konventionelle metoder, der normalt kræver kloning af fusion protein genet til udtryk vektorer til at udtrykke det i pattedyrceller til at analysere kavalergang. Fra start til slut, kan dette tage flere dage op til et par uger, mens peptid assays præsenteres her kan ske inden for en dag så snart peptider og proteaser er tilgængelige. Opsætning af analysen tager mellem 5 og 30 min afhængig af antallet af prøver og runtime i pladelæseren Fluorescens er 1 h. analyse af dataene, der kan tage op til 2 h igen afhængigt af prøvestørrelse.
Her, vi har valgt to forskellige eksempler præsentere analysen. I det første eksempel præsenterer vi data, der sammenligner en furin-medieret kløvningen af menneskelige og camel-afledte MERS-CoV, til at vurdere de kamel-afledte stammer af bliver aktiveret i mennesker, hvis de krydser artsbarrieren. I det andet eksempel, vi anvendte et fluorogenic peptid assay til at bestemme furin-medieret kløvningen af S1/S2 og S2′ websteder eller S2′ site af to serotype jeg og to serotype II FCoV stammer, henholdsvis. For disse eksperimenter brugte vi trypsin kavalergang som positiv kontrol.
Vi præsenterer her et fluorogenic peptid assay, der giver mulighed for en hurtig screening af protein-sekvenser for deres proteolytiske spaltning af proteaser. I vores første eksempel valgte vi forskellige kavalergang site motiver af MERS-CoV spike (S) protein til at illustrere en ansøgning til dette assay. Flere kappeklædte vira, der besidder klasse jeg fusion proteiner som MERS-CoV, SARS-CoV (alvorlig akut luftvejssyndrom) og influenza er store bekymringer for den offentlige sundhed og nye undertyper under konstant udvikling, har et potentiale til at krydse arter barrierer fra deres naturlige værter at mennesker1,15,16. Isolere virus og dyrke dem i laboratoriet kan ikke altid være muligt eller kræver særlige laboratorier, der ikke er tilgængelige i alle forskningsfacilitet. Der er derfor behov for metoder til at vurdere den potentielle trussel mod folkesundheden i emerging vira, der kan udføres under regelmæssig laboratorieforhold. Ud over virus rettet mod mennesker, nogle dyr virus ligesom FCoV også besidder den samme klasse i fusion proteiner, derfor, med lignende egenskaber end deres menneskelige modstykker. Isolere disse vira kan også være en udfordring, at gøre brug af innovative værktøjer til at studere dem nødvendige.
Et afgørende skridt i de ovennævnte virus livscyklus er vært celleindtastning og fusion medieret af proteolytiske behandling af de respektive fusion protein af vært proteaser1,2. En standard måde at undersøge denne del af viral livscyklus er at klone fusion protein gen i et pattedyr udtryk vektor, transfect pattedyrceller, der giver mulighed for protein udtryk, inkuberes eller co transfect med protease af interesse, isoleres de protein og udføre en western blot analyse. Denne metode kommer med flere begrænsninger: tilgængeligheden af viralt DNA/RNA for kloning, omkostninger til syntese af genet, hvis ingen DNA eller RNA er tilgængelig, tilgængelighed af et antistof til påvisning fusion protein og dens kavalergang produkt(er), og det kan tage til flere uger indtil hele undersøgelsen er udført. Det bliver endnu mere tidskrævende, penge og arbejdsintensive hvis interesse af studiet er at undersøge flere mutationer i webstedet kavalergang, fordi det kræver site-directed mutagenese. Fluorogenic peptid analysen beskriver vi her har ikke disse begrænsninger. Peptider af interesse kan være designet baseret på offentligt tilgængelige sekvenser, der er flere leverandører, der leverer en bred vifte af rekombinant proteaser, der er relevante for disse former for undersøgelser og analysen herunder analyse kan udføres inden for en enkelt dag.
I vores eksempel, undersøgte vi furin-medieret spaltning af S2′ protease genkendelsessekvens MERS-CoV S protein afledt af mennesker og kameler fra Egypten og Marokko. Både den menneskelige EMC/2012 og kamelen HKU205 S2′ websteder indeholder en typisk RXXR furin kavalergang motiv. Men ifølge PiTou 2.0 kavalergang scoring algoritme HKU205 S2′ websted forventes ikke at være kløvet af furin, som vi eksperimentelt bekræftet19. Grunden hvorfor HKU5 S2′ behandles ikke af furin muligvis på grund af isoleucin i P1′ holdning. Hvor vi testede to peptider, som de enkelte mutationer i EMC/2012 S2′ sekvens, vi var i stand til at bekræfte, at isoleucin i P1′ stort set ophæver kavalergang, hvorimod alanin Serin substitution resulterede i nedsat kavalergang. Mor213 S2′ websted indeholder ikke en furin kavalergang motiv og det var ikke overraskende at opdage næsten ingen kavalergang. Vi undersøgte også, hvordan furin kløver S1/S2 og S2′ protease genkendelsessekvenser FCoV S protein. Vi var i stand til at overholde furin spaltning af begge FECV peptider (FECV I og-4 S1/S2 og FECV II 1683 S2′), mens muterede sekvenser fra FIPV virus ikke var kløvet af furin.
Når man sammenligner furin-medieret kløvningen af EMC/2012 S2′ peptid (figur 1A) med FECV I og-4 S1/2 peptider (figur 2A), vi fandt, at der var en omtrentlig 26-fold forskel i Vmax. Dette kan forklares ved furin kavalergang motiv i begge sekvenser (tabel 1). Mens minimumskravet til furin kavalergang er et RXXR motiv, er en RXRR sekvens langt mere favorable2. Derfor, EMC/2012 S2′ peptid, som har en RSAR motiv, er kløvet med mindre specificitet i forhold til FECV I og-4 S1/2 peptid, der indeholder en RSRR furin kavalergang websted (tabel 1).
En stor begrænsning af analysen er imidlertid peptider ikke afspejler den tertiære struktur af det protein, de er som regel indlejret i. Spaltning af fuld længde fusion protein udsætter fusion peptid og udløser vært celle løsning1. Samspillet mellem protease og fusion protein er også påvirket af den tertiære struktur af fusion protein, mens vi går ud fra at peptider er mere eller mindre lineære. Dermed kavalergang opdaget i peptid-analysen kan være kunstig og kan ikke afspejle i vivo situation. Dette blev rapporteret til spaltning af influenza H3N2 HA undertype af matriptase. Mens flere grupper beskrevet spaltning af den H3N2 HA af matriptase i peptid assays, blev det også vist, at inkubering af fuld længde H3N2 HA protein og matriptase i cellekultur ikke resulterede i en fusogenic HA protein4,20, 21. Der er andre eksempler, der viser, at biologisk vigtige regulering af proteolytiske kløvningen er på niveauet af protein kropsbygning. Det er blevet beskrevet, at fusion proteiner undertiden har brug for en række pre fusion begivenheder at udsætte kavalergang websteder ved fusion. Semliki skov virus fusion protein, for eksempel kræver strukturelle rearrangementer under en række af prefusion arrangementer for at udsætte sin fusion protein og gøre den tilgængelig for proteolytisk aktivering22. Resultaterne fra et fluorogenic peptid assay skal derfor være valideret celle fusion assays eller lignende eksperimenter. Men peptid-analysen stadig tillader en hurtig screening af flere protease/peptid kombinationer og reducere arbejdskraft og tid af opfølgning eksperimenter da kombinationer, der ikke viser kavalergang er meget tilbøjelige til at udstille den samme resultat i vivo.
Den anden store begrænsning af analysen vedrører proteaser. Hidtil er det kun muligt at teste opløselige proteaser men ikke transmembrane proteaser. Afhængigt af formålet med forsøget, kan dette være et problem. For eksempel, aktiveres influenza har ved en række transmembrane proteaser placeret i cellemembraner8. Til en vis grad, dette problem kan omgås ved hjælp af de opløselige proteolytiske aktive domæner, men resultaterne skal fortolkes med forsigtighed og skal valideres med konventionelle metoder. Vi vil henvise til det ovennaevnte eksempel med matriptase og sin aktivitet mod H3N2 HA. In vivo matriptase ligger i cellemembranen men de kommercielt tilgængelige enzym er den opløselige katalytiske domæne. Som drøftet med hensyn til fusion proteiner, kan det være muligt, at det også kræver det fuld længde protease at interagere med fuld længde protein substrat at opnå kavalergang og at teste kun enkelt domæner kan resultere i falske positiver.
Denne metode har vist sig for at være effektiv til at studere kløvningen af specifikke aminosyre-sekvenser ved furin. Imidlertid programmer af teknik udvidelser til enhver tilgængelig protease (f.eks., cathepsins, proprotein convertase), hvilket gør det en nyttig metode til skærmen peptid kandidater til protease kavalergang. Desuden, det har vist sig at denne analyse kan også bruges til at teste effekten for proteasehæmmere og derfor giver en hurtig og nem at værktøj til skærmen protein hæmmere23.
Fluorogenic peptid kavalergang analysen beskrives her repræsenterer en tilføjelse til bioinformatic kavalergang scoring algoritmer, som forudsiger peptid spaltning af en beslutsom protease, baseret på aminosyre egenskaber og sekvens. Disse to teknikker, i kombination med tradition western blotting teknikker kan bruges som en effektiv metode til at studere protease kavalergang in vitro.
The authors have nothing to disclose.
Forskningsmidler til MERS projektet præsenteret i dette manuskript blev leveret af NIH give R21 AI111085. Feline coronavirus undersøgelse blev støttet af forskningstilskud fra Morris Animal Foundation, Winn Feline Foundation og Cornell Feline Health Center. Vi vil også gerne takke Malik Peiris for at give os med Mor213 sekvens, før det var offentligt tilgængeligt.
Peptides | Biomatik | N/A | |
Furin | NEB | P8077S | |
Trypsin, TPCK-treated | Sigma-Aldrich | 4352157-1KT | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
Triton-X100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
PBS | Corning | 21-040-CV | |
SpectraMax Gemini XPS | Molecular Devices | XPS | |
SoftMax Pro 6.5.1 | Molecular Devices | N/A | |
96-well plate (solid black polystyrene with a flat bottom and non-treated) | Costar | 3915 | |
Light damping tubes | Watson Lab | 131-915BL or 131-915BR | |
Microsoft Excel | Microsoft | N/A | |
Prism 7 | GraphPad | N/A |