Isolement, purification et différenciation des précurseurs d’Ostéoclast de la moelle osseuse de rat

Summary

Les ostéoclastes sont des polycaryons macrophages spécifiques aux tissus dérivés de la lignée monocyte-macrophages des cellules souches hématopoïétiques. Ce protocole décrit comment isoler les cellules de la moelle osseuse afin que de grandes quantités d’ostéoclastes soient obtenues tout en réduisant le risque d’accidents que l’on retrouve dans les méthodes traditionnelles.

Abstract

Les ostéoclastes sont de grandes cellules multinucléées et de résorbage osseux de la lignée monocyte-macrophages qui sont formées par la fusion de monocytes ou de précurseurs de macrophages. La résorption osseuse excessive est l’un des mécanismes cellulaires les plus significatifs conduisant à des maladies ostéolytiques, y compris l’ostéoporose, la parodontite et l’ostéolyse périprosthétique. La principale fonction physiologique des ostéoclastes est d’absorber à la fois la composante minérale de l’hydroxyapatite et la matrice organique de l’OS, générant l’aspect de la résorption caractéristique sur la surface des os. Il ya relativement peu d’ostéoclastes par rapport à d’autres cellules dans le corps, en particulier dans les os adultes. Des études récentes ont porté sur la façon d’obtenir des ostéoclastes plus matures en moins de temps, ce qui a toujours été un problème. Plusieurs améliorations dans les techniques d’isolement et de culture se sont développées dans les laboratoires afin d’obtenir des ostéoclastes plus matures. Ici, nous introduisons une méthode qui isole la moelle osseuse en moins de temps et avec moins d’effort par rapport à la procédure traditionnelle, à l’aide d’un dispositif spécial et simple. Avec l’utilisation de la centrifugation par gradient de densité, nous obtenons de grandes quantités d’ostéoclastes entièrement différenciés de la moelle osseuse de rat, qui sont identifiés par des méthodes classiques.

Introduction

L’homéostasie osseuse est un processus physiologique complexe qui est régulé par des ostéoblastes de résorbage osseux et des ostéoclastes formant des os¹. Un équilibre entre l’activité ostéoblastique et l’ostéoclaste induite par les ostéobenzènes et les ostéoclastes, respectivement, est très essentiel pour maintenir la santé osseuse et l’homéostasie, car les perturbations de l’homéostasie osseuse peuvent entraîner des maladies osseuses, telles comme une croissance osseuse anormale ou une perte de densité osseuse. En tant que cellules uniques de résorption osseuse, les ostéoclastes sont importantes dans les maladies liées à la destruction osseuse anormale, y compris l’ostéoporose, la parodontite et l’ostéolyse périprosthétique^2,3.

Le développement d’une culture ostéosclast est principalement divisé en deux étapes. Les méthodes établies par Boyde et coll.⁴ et Chambers et coll.⁵ composaient la première étape dans les années 1980. Ils ont obtenu des ostéoclastes relativement abondantes à partir des os des animaux nouveau-nés, qui est la période de remodelage rapide. Les ostéoclastes sont libérés par la fragmentation et l’agitation des os dans un milieu spécial. Cependant, les cellules obtenues par cette méthode sont faibles en quantité et en pureté. La deuxième étape a été le développement de cultures à longue distance de formation d’ostéoclast, utilisant des cellules de lignée hématopoïétique dérivées de la moelle osseuse⁶. Les cytokines, telles que la 1 α, la 25-dihydroxyvitamine D3, la prostaglandine E2 (PGE-2) et l’hormone parathyroïde (PTH), qui sont ajoutées dans le milieu de culture, agissent par l’intermédiaire du système des cellules ostéoblastes/stromales pour stimuler la formation d’ostéoclast^7,8 . Cependant, la pureté et la quantité d’ostéoclastes obtenues par cette méthode ne peuvent pas répondre aux besoins de la recherche moderne en biologie moléculaire. Ensuite, la découverte du facteur stimulant des colonies de macrophages (M-CSF) et de l’activateur du récepteur pour le ligand nucléaire de facteur-κB (RANKL) rend l’ostéoclastogenèse plus facile^9,10,11, et la méthode d’utilisation de m-CSF et RANKL pour stimuler directement la formation d’ostéosclast est largement utilisé dans le monde entier. Cependant, il y a encore quelques détails dans la méthodologie qui doivent être améliorés.

Actuellement, la méthode de culture d’ostéoclast la plus couramment utilisée, telle que décrite par Marino et al.¹² et PEI et al.¹³, nécessite souvent l’enlèvement du tissu environnant autour de l’os et utilise une aiguille stérilisée pour rincer la cavité médullaire avec les médias complétés. Il y a quelques inconvénients à ce processus, y compris le fait que (1) l’enlèvement du tissu environnant autour de l’OS nécessite beaucoup de temps et une grande technique chirurgicale, (2) les os sont fragiles et peuvent conduire à l’écoulement de la moelle osseuse, (3) la cavité de la moelle osseuse pourrait être trop petit pour rincer, et (4) il y a un risque de blessure de bâton d’aiguille. Pour éviter ces problèmes, nous centrifuger les tubes contenant les os pour la moelle osseuse au lieu de l’aiguille-rinçage de la moelle osseuse. Ici, nous introduisons une méthode stable et sûre qui isole la moelle osseuse en moins de temps et avec moins d’effort comparé à la procédure traditionnelle. Avec l’utilisation de la centrifugation par gradient de densité, nous obtenons de grandes quantités d’ostéoclastes entièrement différenciés in vitro.

Protocol

Toutes les méthodes impliquant les animaux décrits ici sont approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de médecine chinoise de Nanjing. 1. Configuration de l’installation Préparer plusieurs pointes de pipette de 1 mL (1 cm) et plusieurs tubes de microcentrifugation de 1,5 mL de façon longitudinale. Mettre les pointes de pipette et les tubes de microcentrifugation à 103 kPa et 121 ° c pendant 20 min et s’assu…

Representative Results

Le but du protocole était d’isoler et de purifier un grand nombre de précurseurs d’ostéoclast commodément et d’induire les ostéoclastes avec succès. En complétant avec M-CSF et RANKL, des ostéoclastes géants ont été observés les jours 5 à 6. La formation d’ostéoclastes a été identifiée avec succès par la coloration TRAP (figure 1a). Les cellules grandes et violettes ont été considérées comme des cellules à piège positif avec pl…

Discussion

La capacité d’obtenir et d’étudier les ostéoclastes in vitro est une compétence critique et fondamentale pour tout chercheur souhaitant étudier le métabolisme osseux, qui peut aider à comprendre les mécanismes des maladies absorbant les os et à développer de nouveaux agents thérapeutiques. La présente étude décrivait un protocole avec quelques modifications fondées sur des méthodes antérieures.

En utilisant des pointes de pipette et des tubes de microcentrifugation pour ob…

Materials

Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit	Sigma-Aldrich	387A
Automatic Hard Tissue Slicer	Lecia	RM2265
Bovine femoral bone			Purchased by ourselves
Cell Incubator	Heraus	BB16/BB5060
Fetal Bovine Serum	Sarana	s-fbs-au-015
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150077
Hard Tissue Grinders	Lecia	SP-2600
Histopaque Kit	TianJing Haoyang	TBD2013DR	Silicified centrifugal tube amd cell separation solution
Hochest33342	Sigma-Aldrich	B2261
Inverted Phase Contrast Microscope	Olympus	CKX31
Inverted Fluorescence Microscope	Lecia	DMI-3000
MEM, no Glutamine	Gibco	11090-081
Penicillin-Streptomycin, Liquid	Gibco	15140122
Rabbit Anti-Calcitonin receptor	Bioss	bs-0124R
Recombinant Rat M-CSF	PeproTech	400-28
Recombinant Rat sRANK Ligand	PeproTech	400-30
Red Blood Cell Lysis Buffer	Absin	abs47014932
Scanning Electron Microscopy	FEI	Quanta 200
Toluidine Blue	Sigma-Aldrich	89649