यहां, हम के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद है वीवो वैधीकरण के hydrogel आधारित सेल थेरेपी, टाप प्रत्यारोपण के उदाहरण से सचित्र । एच-ओमेंटल मैट्रिक्स टाप फिलिंग (होमिंग) प्रत्यारोपण एक उचित चयापचय वातावरण में engraftment को अधिकतम करने के लिए, रक्त वाहिकाओं के पास, Omental परतों के बीच एक सेल-हाइड्रोगेल मिश्रण के प्रत्यारोपण की अनुमति देता है ।
पुनर्योजी चिकित्सा कोशिका चिकित्सा पर आधारित रोग के इलाज के लिए एक नई आशा का प्रतिनिधित्व करता है. वर्तमान बाधाओं चिकित्सा की दक्षता के vivo सत्यापन में उचित शामिल हैं । प्राप्तकर्ता के शरीर में स्थानांतरण के लिए, कोशिकाओं को अक्सर बायोटेरियल्स, विशेष रूप से हाइड्रोजैल के साथ संयोजित करने की आवश्यकता होती है । हालांकि, इस तरह के एक भ्रष्टाचार की प्रभावकारिता के सत्यापन सही वातावरण, सही hydrogel, और सही प्राप्तकर्ता साइट की आवश्यकता है । ओमेंटूम इस तरह के एक साइट हो सकता है । टाप ट्रांसप्लांटेशन के उदाहरण के आधार पर, हम homing विकसित (एच Omental मैट्रिक्स टाप भरने) तकनीक, जो ऊतक के अंदर भ्रष्टाचार के इंजेक्शन के होते हैं, Omental परतों के बीच में, टाप प्रत्यारोप और अस्तित्व में सुधार करने के लिए । इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, आइलेट्स को एक चिपचिपापन के साथ एक हाइड्रोजेल में एम्बेडेड किया जाना चाहिए जो एक एटार्मेटिक सुई का उपयोग करके इंजेक्शन को सक्षम बनाता है । सिरिंज हाइड्रोजेल और islets के संयोजन के साथ भरी हुई हैं । विभिन्न प्रवेश बिंदुओं पर omental ऊतक के अंदर कई इंजेक्शन प्रदर्शन कर रहे हैं, और टाप/हाइड्रोगेल मिश्रण का जमाव एक लाइन के साथ किया जाता है । हम डेक्सट्रान मोती का उपयोग कर इस अभिनव दृष्टिकोण की व्यवहार्यता का परीक्षण किया । मोती पूरी तरह से रक्त वाहिकाओं के करीब निकटता में, omental ऊतक भर में फैले हुए थे । graft की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए, हम मधुमेह चूहों में islets प्रत्यारोपित और दो महीने से अधिक एक चयापचय अनुवर्ती प्रदर्शन. प्रत्यारोपित islets पुनः के एक उच्च दर का प्रदर्शन-आसपास और islets के अंदर vascularization, और रिवर्स मधुमेह । homing तकनीक हाइड्रोजेल या सेल थेरेपी के अंय प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है, उच्च चयापचय गतिविधि के साथ कोशिकाओं के लिए ।
कोशिका चिकित्सा एक गर्म विषय है, के रूप में यह पुनर्योजी दवा के आधार पर रोगों का इलाज करना है । जैविक सामग्री की सहायता से सेल चिकित्सा हाल के वर्षों में तेजी से अध्ययन किया गया है, खासकर इसलिए कि सेल प्रत्यारोपण अक्सर संस्कृति डिश से प्राप्तकर्ता के लिए कोशिकाओं के हस्तांतरण के लिए एक वाहक की आवश्यकता है । बायोमेट्रिक मचानों संभावित मूल्यवान सेल वाहक है कि कई भूमिकाओं को पूरा कर रहे हैं1. एक सक्षम वाहक यांत्रिक तनावों से कोशिकाओं की रक्षा करना चाहिए और अनुकूल विकास की स्थिति प्रदान करना चाहिए, जैसे आवश्यक वृद्धि कारकों, चयापचय अपशिष्ट उत्सर्जन, पोषक तत्वों का विनिमय, और ऑक्सीजन2.
सेल थेरेपी में इस्तेमाल किए जाने वाले विभिन्न प्रकार के बायोटेरियल्स के अलावा, हाइड्रोजैल में कई फायदे हैं । वे biocompatible हैं, biodegradable, संभाल करने के लिए आसान है, और ऑक्सीजन प्रसार3की सुविधा । इसके अलावा, वर्तमान प्रौद्योगिकी hydrogels के उपयोग की अनुमति देता है कोशिकाओं को जीवित और engraft के साथ, उदाहरण के लिए, वृद्धि कारकों या अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स प्रोटीन4के साथ पूरकता ।
स्टेम सेल युक्त हाइड्रोजेल वाहक उपचार, जैसे, अस्थि पुनर्जनन5 और तंत्रिका तंत्र रोग6के रूप में इंजेक्ट किया जा सकता है । metabolically सक्रिय कोशिकाओं के प्रत्यारोपण की जरूरत है. जबकि विट्रो में दृष्टिकोण का सत्यापन संभव है, उपकरण और तकनीक के लिए vivo सत्यापन में परिष्कृत रहने के लिए रहते हैं ।
सेल और हाइड्रोजेल ट्रांसप्लांटेशन को आसानी से उपचर्म इंजेक्शन द्वारा किया जा सकता है जब biocompatibility परीक्षण आयोजित किए जाते हैं । हालांकि, जब इसराईल कोशिकाओं को उनके चयापचय कार्रवाई द्वारा प्रणालीगत कारकों को विनियमित करने के लिए होती हैं, इस चमड़े के नीचे स्थानीयकरण इष्टतम नहीं है, अनिवार्य रूप से शिरापरक जल निकासी के मामले में7. इसलिए, जल्दी से, सुरक्षित रूप से, और कुशलता से एक hydrogel के लाभकारी प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए कोई मौजूदा उपकरण हैं । टाप ट्रांसप्लांटेशन के उदाहरण के आधार पर, जिसमें यह आवश्यक है कि हार्मोन रक्त शर्करा के स्तर के जवाब में भ्रष्टाचार से खून में जारी किया जाए, हमने विवो में सेल/हाइड्रोगेल प्रत्यारोपण के लिए एक नई विधि विकसित की ।
पहले कदम के लिए एक ग्राही प्रत्यारोपण साइट है, जो कोशिकाओं के साथ एक हाइड्रोजेल स्वीकार कर सकते है की पहचान थी । ओमेन्टम प्रत्यारोपण के लिए एक बड़ी जगह प्रदान करता है, अत्यधिक प्लास्टिक है, और intraperitoneal सेटिंग के साथ संयुक्त इसकी सघन वाहियात उच्च चयापचय गतिविधि8वाले कोशिकाओं के अध्ययन के लिए दिलचस्प है । हम अगले एक शल्य चिकित्सा कोशिकाओं के हस्तांतरण और ओमेंटम में हाइड्रोजेल की अनुमति तकनीक की स्थापना की जरूरत है । प्लास्टिक सर्जरी9में इस्तेमाल किया lipofilling से प्रेरित होकर, हम एच omental मैट्रिक्स टाप भरने (homing) दृष्टिकोण विकसित की है । आइलेट्स हाइड्रोजेल में एम्बेडेड omental ऊतक के अंदर इंजेक्शन रहे हैं । तकनीक भी omental ऊतक है, जहां रक्त वाहिकाओं की बड़ी संख्या में भी भ्रष्टाचार oxygenation में सुधार में सेल और हाइड्रोजेल मिश्रण के कई जमाव का उपयोग करके अधिकतम engraftment प्रदान करने के उद्देश्य से ।
वर्तमान अध्ययन में, हम omental चादरें के बीच टाप प्रत्यारोपण के लिए एक सरल और अभिनव तकनीक का वर्णन, वसा ऊतक रक्त वाहिकाओं के निकटतम के अंदर. यह सूक्ष्म इनवेसिव सर्जरी के होते हैं, जो लेप्रोस्कोपी के तहत पूरा किया जा सकता है, वसा ऊतक में एक हाइड्रोजेल में निहित islets के इंजेक्शन के साथ । यह तकनीक आसानी से सभी हाइड्रोजेल और सेल संयोजनों है कि एक में एक metabolically कार्यात्मक वातावरण में परीक्षण करने की आवश्यकता के लिए लागू है ।
इस प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण चरणों को हाइलाइट किया जा सकता है । सबसे पहले, सर्जरी और ऊतकों को हेर-फेर करने वाले व्यक्ति को वसा ऊतक के साथ नाजुक होना चाहिए, क्योंकि यह नाजुक है । ओमेन्टम को कुचलने या हानिकारक होने से बचा जाना चाहिए । ओमेन्टम, एक रक्षात्मक ऊतक के रूप में, मैक्रोफेज और अन्य ल्यूकोसाइट्स में समृद्ध है । इन प्रतिरक्षा कोशिकाओं अत्यधिक हेरफेर द्वारा सक्रिय किया जा सकता है और नकारात्मक भ्रष्टाचार को प्रभावित कर सकता है । दूसरे, भ्रष्टाचार (टाप-हाइड्रोगेल मिश्रण) लोडिंग भी महत्वपूर्ण है । प्रक्रिया प्रदर्शन व्यक्ति मृत मात्रा से बचना चाहिए और इंजेक्शन डिवाइस में hydrogel-टाप मिश्रण के सभी लोड करना होगा. इस कदम के तुरंत बाद, एक और महत्वपूर्ण बिंदु इंजेक्शन ही है । इंजेक्शन धीरे से किया जाना चाहिए, देखभाल के साथ, और नाजुक. सिरिंज खाली हाइड्रोजेल द्वारा किसी भी शेष islets पुनः प्राप्त करने के लिए शुरू में लोड निकाल दिया होना चाहिए । तीसरा, suturing ध्यान से और दो चरणों में किया जाना चाहिए । पेशी की योजना पहले सिलाई किया जाना चाहिए, देखभाल मांसपेशी के साथ ओमेंटूम सीवन नहीं करने के लिए, और त्वचा अलग से सिलाई किया जाना चाहिए । omental भ्रष्टाचार के लिए अन्वेषण प्रक्रिया के बारे में, विशेष ध्यान इस समय लिया जाना चाहिए जब धमनियों के बंद पेट (gastroepiploic धमनियों) चीरा कर रहे हैं । किसी भी रक्तस्राव के लिए ध्यान देना महत्वपूर्ण है जो जानवर को बंद करने से पहले उन्हें रोकता है, क्योंकि किसी भी लगातार रक्तस्राव से कई दिनों के भीतर पशु मौत हो जाती है ।
islets ले जाने के लिए माध्यम के बारे में समस्या निवारण आवश्यक हो सकता है; हाइड्रोजेल का विकल्प प्रयोगकर्ता के पास है, जब तक हाइड्रोजेल का इंजेक्शन है । विभिंन सामग्रियों का उपयोग चर भ्रष्टाचार समारोह में परिणाम कर सकते है (के साथ या बिना पूरकता, उदाहरण के लिए) । विधि यहां वर्णित निष्क्रिय सह के लिए अपनी दक्षता साबित कर दिया है ७६६० ieq की एक टाप अनुपात के साथ सामग्री प्रत्यारोपण/
वर्तमान विधि omental आकार और हाइड्रोजेल गुण द्वारा सीमित किया जा सकता है । एक मधुमेह कृंतक मॉडल का उपयोग करने के लिए, इंसुलिन थेरेपी पहले टाप प्रत्यारोपण करने के लिए पर्याप्त ग्राफ्टिंग क्षेत्र प्रदान करने के लिए अनिवार्य है । मधुमेह कृंतकों stz प्रेरित मधुमेह के कारण वजन और वसा द्रव्यमान का एक बहुत कुछ खोना । इस अध्ययन में नामांकित पशुओं के छोटे वजन को ध्यान में रखते हुए, एक भी छोटे क्षेत्र में कलम लगाना संभव नहीं है ।
उचित glycemia प्रबंधन के संरक्षण (छर्रों का उपयोग कर प्रत्यारोपण और उसके बाद लंबे समय से अभिनय इंसुलिन का उपयोग करने से पहले) अनिवार्य है । यहां, हम कई कारणों के लिए प्रत्यारोपण के दिन तक इंसुलिन गोली संरक्षण के लिए चुना है । सबसे पहले, एक उचित ग्लाइसेमिक नियंत्रण के रखरखाव काफी ऑक्सीडेटिव प्राप्तकर्ता अंगों में मधुमेह द्वारा प्रेरित तनाव कम कर देता है, जो टाप भ्रष्टाचार11 के लिए हानिकारक हो सकता है और गहन इंसुलिन थेरेपी और प्राप्तकर्ता की निरंतरता की अनुमति देता है तैयारी क्लिनिक में मनाया12. दूसरा, हम चूहों के लिए संज्ञाहरण प्रक्रियाओं की अधिकतम संख्या को सीमित करना चाहता था. लंबे समय से अभिनय इंसुलिन का उपयोग करते हुए चयापचय अनुवर्ती के दौरान इंसुलिन थेरेपी के कार्यान्वयन के बारे में, इस योजना का इस्तेमाल ग्लूकोसिटी के कारण बड़े पैमाने पर जटिलताओं से बचा जाता है (जो grafts को नष्ट कर सकता है) और एक “वास्तविक” ग्लाइसीमिया मूल्य का संरक्षण करने के लिए ।
भ्रष्टाचार दक्षता की निगरानी करने के लिए, glycemia पहले कुछ दिनों में एक प्रासंगिक पैरामीटर नहीं है अगर चूहों इंसुलिन चिकित्सा छर्रों का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं. यही कारण है कि सी-पेप्टाइड स्तर की जाँच से पूर्व कई बार प्रत्यारोपण करना अनिवार्य है. इन बार अध्ययन की शुरुआत में शामिल हैं, stz इंजेक्शन के बाद पशुओं का चयन करने के लिए, और फिर सिर्फ प्रत्यारोपण पूर्ववर्ती, यह सुनिश्चित करने के लिए कि चूहों मधुमेह रहने और कि उत्थान कम है.
हाइड्रोगेल गुण भी महत्वपूर्ण हैं । तरल हाइड्रोजेल omental ऊतक के बाहर रिसाव होगा और उच्च चिपचिपा हाइड्रोजेल इंजेक्शन नहीं होगा । hydrogel चिपचिपापन और इंजेक्शन का उपयोग करने से पहले परीक्षण किया जा करने के लिए है, लेकिन यह भी सीधे टाप या किसी अन्य कोशिकाओं विट्रो में अस्तित्व के मूल्यांकन द्वारा सामग्री का परीक्षण करने के लिए आवश्यक प्रतीत होता है. यहाँ, के रूप में islets हाइपोक्सिया के लिए बहुत संवेदनशील हैं और एक उच्च चिपचिपा वाहक का उपयोग ऑक्सीजन प्रसार को प्रभावित कर सकते हैं.
मौजूदा तरीकों के संबंध में यहाँ वर्णित विधि के महत्व के संदर्भ में, इस अंतर-ऊतक प्रत्यारोपण तकनीक पुनरुत्पादन की अवधि में लाभ है. यह ऊतक के लिए भी अप्रोच है और इसके अतिरिक्त संवहनी स्थान के कारण, रक्तस्राव और थ्रोम्बोसिस जोखिम से बचाता है । इसके अलावा, जब टाप ट्रांसप्लांटेशन पर विचार, तत्काल रक्त मध्यस्थता भड़काऊ प्रतिक्रिया से बचा जाता है14. इसके अलावा, homing islets प्रत्यारोपण एक गैर महत्वपूर्ण अंग में, जिगर, जो यकृत समारोह के मामले में जोखिम बन जाता है में प्रत्यारोपण के विपरीत की अनुमति देता है15.
इष्टतम प्रदर्शन का उत्पादन करने के लिए, एक हाइड्रोजेल के लिए यह ले जाएगा कोशिकाओं को अनुकूलित किया जाना है । वृद्धि कारकों या विशिष्ट प्रोटीन का उपयोग प्रतिरोपित कोशिकाओं पर सकारात्मक प्रभाव हो सकता है16,17.
समाप्त करने के लिए, इस तकनीक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है vivo में एक हाइड्रोजेल के सत्यापन के विभिंन प्रकार के सेल, खासकर जब एक सक्रिय चयापचय वातावरण की जरूरत है, islets के लिए के रूप में । इसके अलावा, इस शल्य चिकित्सा तकनीक कई अनुप्रयोगों के लिए लागू है और हो सकता है, भविष्य में, तेजी से मनुष्यों के लिए अंतरणीय, के रूप में यह आसानी से लेप्रोस्कोपी का उपयोग किया जा सकता है.
The authors have nothing to disclose.
यह काम région alsace द्वारा वित्त पोषित किया गया था, bioartmatrix-pôle alsace बायोवैली-cqdm; 53/14/C1. लेखक पीआर की टीम के लिए आभारी हैं । इस अभिनव तकनीक के विकास में मदद करने के लिए hôpitaux विश्सिटेयर्स डे स्ट्रासबर्ग से bruant-rodier ।
Alginate (PRONOVA UP LMV) | Novamatrix | 4200206 | Hydrogel carrier |
Atraumatic needle (Blunt) | B.Braun | 9180109 | |
CMRL without FBS | Gibco | 11500576 | |
C-peptide ELISA kit | Mercodia | 10-1172-01 | |
Eosin | Leica Microsystems | 3801592E | |
Ethilon 4/0isoflo | Ethicon | F2414 | Surgical suture |
Hematoxylin | Leica Microsystems | 3801562E | |
Insulin pellets | Linshin | INS-B14 | |
Isofluorane | Centravet | ISO007 | |
Lantus (Insulin-Glargin) | Sanofi Adventis | Lantus SoloStar | Long acting insulin |
Metacam | Boehringer Ingelheim | MET019 | Anti-inflammatory drug |
NaCl (for saline 0.9%) | Sigma | 10112640 | |
Needle 26G | TERUMO | 050101B | |
Oxygen | Linde | 2010152 | For isoflurane use |
Pentobarbital sodique | Vetoquinol | Dolethal | For euthanasia |
Steranios 2% | Anios | 11764046 | |
Streptozotocin | Santa-Cruz | SC-200719A | |
Syringe – Injekt-F | B.Braun | 9166017V | |
Trocar & stylet (linshin) | Linshin | G12-SS | For pellet insertion |