الحجم المتوسط الجسيمات الصورة فيلوسيميتري دراسات Neurovascular التدفقات في المختبر
Summary
نقدم هنا أساليب مبسطة لاختلاق أشباح neurovascular شفافة وتميز التدفق فيه. تسليط الضوء على العديد من المعالم الهامة، وتثبت علاقتها بدقة الحقل.
Abstract
فيلوسيميتري صورة الجسيمات (PIV) يستخدم في طائفة واسعة من المجالات بسبب الفرصة ويوفر دقة تصور وتحديد كمية التدفقات عبر مجموعة كبيرة والزمانية المكانية. بيد أن تنفيذه يتطلب عادة استخدام الأجهزة باهظة الثمن والمتخصصة، مما يحد من فائدتها أوسع نطاقا. وعلاوة على ذلك، ضمن مجال الهندسة الحيوية، في المختبر تدفق التصور الدراسات غالباً ما تكون أيضا زيادة محدودة بالتكلفة العالية لأشباح الأنسجة تجارياً المصدر أن الخص الهياكل التشريحية المطلوبة، لا سيما بالنسبة التي تمتد عبر نظام المتوسطة المدى (أي، سوبميليميتير إلى جداول طول ملليمتر). هنا، فإننا نقدم بروتوكول تجريبي مبسطة لمعالجة هذه القيود، وتشمل العناصر الرئيسية التي 1) أسلوب التكلفة المنخفضة نسبيا لاختلاق أشباح الأنسجة المتوسطة المدى باستخدام الطباعة ثلاثية الأبعاد وصب السيليكون، و 2) إطار تحليل ومعالجة الصورة المصدر المفتوح الذي يقلل من الطلب على الأجهزة لقياس التدفقات المتوسطة المدى (أي، سرعات تصل إلى عشرات مليمترات/ثانية). جماعياً، وهذا يخفض الحاجز لدخول نونيكسبيرتس، بالاستفادة من الموارد بالفعل في التخلص من كثير من الباحثين الهندسة الحيوية. ونحن ديمونستراتيث تطبيق هذا البروتوكول في إطار توصيف تدفق neurovascular؛ بيد أنه من المتوقع أن تكون ذات صلة بمجموعة أوسع من التطبيقات المتوسطة المدى في الهندسة الحيوية، وما بعدها.
Introduction
PIV يستخدم على نطاق واسع في ميكانيكا الموائع التجريبية للتصور تدفق والتحقيقات الكمي لحركة السوائل التي تختلف في مقياس الطول من الغلاف الجوي إلى تدفقات ميكروسيركولاتوري1،،من23. بينما يمكن أن تختلف التفاصيل المتعلقة بتنفيذه على نطاق واسع تطبيقاتها، أحد الجوانب المشتركة لما يقرب من جميع الدراسات PIV هو استخدام التصوير بالفيديو للجسيمات الراسم المصنفة ضمن السائل العامل، متبوعة بتحليل لبير لإطارات الصور على التوالي لاستخراج خصائص تدفق المرجوة. عادة، يتم ذلك عن طريق تقسيم كل إطار الصورة الأولى إلى مناطق أصغر يسمى windows الاستجواب. نتيجة لمواقف عشوائية للجسيمات المشتتة، يحتوي كل إطار الاستجواب على توزيع كثافة بكسل بصورة فريدة من نوعها. إذا كان يتم اختياره بمعدل اقتناء البيانات وحجم النافذة على نحو ملائم، يمكن استخدامها عبر الارتباط الإشارة كثافة في كل إطار لتقدير متوسط نزوح داخل تلك المنطقة. أخيرا، نظراً لأن التكبير ومعدل الإطار معروفة البارامترات التجريبية، حقل متجه سرعة لحظية يمكن أن سهولة حسابها.
ميزة كبيرة من PIV على تقنيات القياس نقطة واحدة هو قدرته على تعيين حقول المتجهات عبر مجال ثنائي أو ثلاثي الأبعاد. تطبيقات الفسيولوجية، على وجه الخصوص، قد استفادت من هذه القدرة، نظراً لأنها تتيح إجراء تحقيق شامل من التدفقات المحلية، التي من المعروف أن تلعب دوراً هاما في أمراض الأوعية الدموية أو يعيد البناء (مثلاً، وتصلب الشرايين، والأوعية) 4 , 5 , 6-كما قد كان هذا صحيحاً لتقييم تدفقات نيوروفاسكولار، والتفاعلات منها مع الأجهزة اللمفاوية (مثلاً، تدفق الموجهات، الدعامات، ولفائف إينتراساككولار)، منذ الطول-الجداول ذات الصلة في مثل هذه التطبيقات يمكن أن وكثيراً ما تمتد عبر واحد أو أكثر من حيث الحجم (مثلاً، من ميكرومتر إلى ملليمتر)، وهندسة الجهاز وموضع يمكن أن يؤثر بشكل ملحوظ في ميكانيكا الموائع المحلية7.
معظم المجموعات إجراء الدراسات الفسيولوجية على أساس PIV يعتمد على الهياكل التجريبية التي تحاكي عن كثب بعض التحقيقات أقرب لتركيب دعامات تأثير على تدفق الأوعية الدموية7،8. بشكل عام، وتشمل هذه) نابض أشعة الليزر والكاميرات عالية السرعة، لالتقاط تدفقات عالية السرعة؛ ب) المزامنات، لمنع التشويش بين تواتر نبض الليزر ومعدل الإطار اقتناء كاميرا؛ ج) البصريات أسطواني، تشكل ورقة خفيفة، وهكذا، التقليل من الأسفار الخلفية من الجسيمات الراسم أعلى وأسفل الطائرة الاستجواب؛ د) بالنسبة للنظم التجارية تسليم المفتاح، حزم البرمجيات المسجلة الملكية، لإجراء التحليلات عبر الارتباط. ومع ذلك، في حين تتطلب بعض التطبيقات على الأداء و/أو براعة جماعياً تتيحها هذه المكونات، العديد من البعض الآخر لا. وعلاوة على ذلك، التكلفة العالية للمصدر تجارياً الأنسجة أشباح الخص هياكل الأوعية الدموية المطلوبة يمكن أن يثبت أيضا تحد للعديد من الدراسات في المختبر ، خاصة بالنسبة لأشباح مع يتميز بهذا الجسر نظام المتوسطة المدى (> 500 دولار أمريكي/ الوهمية). هنا، نحن تقرير وضع بروتوكول مبسط لتنفيذ PIV للتصور في المختبر تدفقات نيوروفاسكولار، التي تقع عادة على حد سواء مكانياً ووقتيا داخل نظام المتوسطة المدى (أيجداول الطول تتراوح من سوبميليميتير إلى ملليمتر، وسرعات تصل إلى عشرات مليمترات/ثانية). ويسعى البروتوكول إلى الاستفادة من الموارد بالفعل في التخلص من كثير من الباحثين في الهندسة الحيوية، وبالتالي خفض الحاجز لدخول نونيكسبيرتس.
العنصر الأول من هذا البروتوكول ينطوي على استخدام أسلوب صب الاستثمار لتمكين تلفيق داخلية شفافة، بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS)-على أساس الأنسجة أشباح من قوالب الذبيحة 3-د-طباعة. برفع مستوى التوافر المتزايد للطابعات ثلاثية الأبعاد في السنوات الأخيرة، لا سيما تلك الموجودة في المشتركة والمتعددة في المستخدمين المرافق (مثلاً، المرافق المؤسسية أو ماكيرسباسيس العامة)، هذه المنهجية خفض التكاليف إلى حد كبير (مثلاً، < 100 دولار أمريكي/الوهمية في القضية المعروضة هنا)، مع تمكين تحول سريع لتصنيع مجموعة واسعة من التصاميم وهندستها. في البروتوكول الحالي، يستخدم ترسيب تنصهر نمذجة النظام مع ستايرين بوتادين أكريلونيتريل (ABS) كمواد البناء، والجزء المطبوع بمثابة قالب الذبيحة لصب الوهمية اللاحقة. وقد أثبتت تجربتنا أن القيمة المطلقة مناسبة تماما لمثل هذا الاستخدام نظراً لأنه قابل للذوبان في المذيبات المشتركة (مثلاً، الأسيتون)، وأنه لديه ما يكفي من قوة وصلابة الحفاظ على سلامة العفن بعد إزالة مواد الدعم (مثلاً، إلى منع تشوه أو الكسر من ميزات العفن ضآلة). في البروتوكول الحالي، العفن هو مواصلة ضمان سلامة استخدام النماذج المطبوعة الصلبة، على الرغم من أن هذا يأتي على حساب وقت زيادة انحلال. قد يكون من الممكن في بعض الحالات، تعزيز وصول المذيبات، وبالتالي، تقليل وقت انحلال أيضا استخدام نماذج جوفاء. ومع ذلك، ينبغي إيلاء عناية للأثر هذا قد على سلامة العفن. أخيرا، بينما أشباح ملفقة هذه الوثيقة تستند إلى تمثيلات المثالية للهياكل نيوروفاسكولار التي تم إنشاؤها باستخدام حزمة برامج تصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD) مشتركة، البروتوكول يتوقع أن تكون قابلة لتلفيق أكثر تعقيداً ، الهندسات الخاصة بالمريض، وكذلك (مثلاً، عن طريق استخدام ملفات نموذج المتولدة عن تحويل بيانات التصوير السريري. STL تنسيق ملف المستخدمة من قبل معظم الطابعات ثلاثية الأبعاد). ترد تفاصيل أخرى فيما يتعلق بعملية تصنيع الوهمية في المادة 2 من البروتوكول.
والعنصر الثاني من البروتوكول ينطوي على استخدام المكونات في إيماجيج لإجراء التحليلات عبر الارتباط9مفتوح المصدر. ويقترن هذا مع تنفيذ مخطط العتبة إحصائية بسيطة (أيفرض حد أقصى لكثافة)10 إلى تحسين إشارة الصورة قبل الارتباط الصليب، فضلا عن ناقلات بوستكوريليشن التحقق من صحة مخطط، تطبيع اختبار متوسط (NMT)، للقضاء على نواقل زائفة من خلال المقارنة بين كل منها إلى أقرب الجيران11. مجتمعة، وهذا ما يسمح التصوير إلى إنجازه باستخدام المعدات التي توجد عادة في العديد من مختبرات الهندسة الحيوية، وبالتالي القضاء على الحاجة للحصول على العديد من مكونات تكلفة نظم PIV نموذجية (مثلاً، الليزر النبضي، “المزامن” والبصريات أسطواني، والبرمجيات المسجلة الملكية). وترد تفاصيل أخرى بشأن جمع الفيديو ومعالجة الصور، وتحليل البيانات في المادتين 5 و 6 من البروتوكول.
ويبين الشكل 1 الهيكل PIV المستخدمة في هذا البروتوكول، الذي يعتمد على مجهر الأسفار مزودة بكاميرا عالية السرعة للتصوير المستمر مصدر الضوء الأبيض (أي، مصباح هاليد معدني)، فضلا عن خارجي، على من خلال الهدف الإضاءة الحجمي. يتم استخدام مضخة متغيرة السرعة والعتاد فرض تدفق تعمل لحل الدم وهمية الشفافية من خلال أشباح الأنسجة نيوروفاسكولار. الحل يتكون من خليط التشكيل منزوع الماء (DI) والجلسرين، وبديل مشترك للدم في الفسيولوجية الدراسات12،،من1314، نظراً) الكثافة واللزوجة (أي، مماثلة 1,080 كجم/م3 و cP 3.5 مقابل 1,050 كجم/م3 و 3-5 cP للدم)16من15،؛ ب) شفافيته في النطاق المرئي؛ ج) الانكسار مماثلة ك PDMS (1.38 مقابل 1.42 ل PDMS)17،18،،من1920، مما يقلل من التشويه البصري؛ د) السهولة مع أي سلوك غير النيوتونية ويمكن إدخال، إذا لزم الأمر، عن طريق إضافة إكسانثاني21. وأخيراً، تستخدم الخرز البوليسترين الفلورسنت كجسيمات الراسم (10.3 ميكرومتر في القطر؛ وشمال البحر الأبيض المتوسط/501 480 نانومتر الإثارة/الانبعاثات). بينما المرغوب فيها الخرز ازدهار محايدة، مصادر جسيمات التتبع مع الأمثل خصائص ميكانيكية السوائل (مثلاًوالكثافة، وحجم وتكوين) والطول الموجي الانبعاثات يمكن أن يثبت صعبة. على سبيل المثال، الخرز المستخدمة هنا قليلاً أقل كثافة من الحل والغليسيرول (1,050 كجم/م3 مقابل 1,080 كجم/م3). ومع ذلك، آثار هيدرودينامية، منها، لا يعتد بها، نظراً لأن مدة تجربة نموذجية أقصر بكثير من مقياس الوقت المرتبطة بآثار الطفو (أي، 5 دقيقة و 20 دقيقة، على التوالي). وترد تفاصيل فيما يتعلق بإنشاء نظام الدورة الدموية الدم وهمية صياغة و في المختبر الحل كذلك في المادتين 3 و 4 من البروتوكول.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول الموضحة هنا طريقة مبسطة لإجراء دراسات PIV لتصور neurovascular يتدفق في الأبعاد ذات الصلة فسيولوجيا وتدفق ظروف المختبر فيالخطوط العريضة. في القيام بذلك، فإنه يخدم لاستكمال البروتوكولات ذكرت قبل الآخرين التي ركزت أيضا على تبسيط التحديد الكمي لحقول المتجهات، ولكن ضمن سياقات مختلف?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب تقر دعم جزئي لهذا المشروع قدمت “منحة Seed التعاونية” من مكتب البحوث والتنمية الاقتصادية في “جامعة كاليفورنيا في ريفرسايد”.
Materials
| Solidworks 2015 | Dassault Systems | N/A | CAD Software |
| Dow Corning Sylgard 184 Kit | Ellsworth Adhesive | 184 SIL ELAST KIT 3.9KG | PDMS Kit |
| Stratasys Dimension Elite | Stratasys | 9180-00105 | 3D printer |
| P430 Model Material Cartridge | Stratasys | 340-21202 | ABS build material |
| P400 SR Soluble Support Material Cartridge | Stratasys | 340-30200 | Support material |
| CleanStation DT3 | PM3 Technologies | 00-00300R | Base bath |
| Lindberg Blue M LGO Box Furnace | Thermo Scientific | LB305745M | Oven |
| 21G BD PrecisionGlide Needle | Betcon Dickenson | BD 305167 | Branching perforator mold segment |
| Desiccator (Vacuum) | Polylab | 55205 | Desiccator |
| Branson 1800 Utrasonic Cleaning | Branson | CPX-952-116R | Sonicator |
| Acetone | Fisher Chemical | A9494 | Acetone |
| Isopropol Alcohol | Fisher Chemical | A4514 | Isopropol Alcohol |
| Glycerol | Fisher Chemical | GW33500 | Glycerol |
| 10um Polystyrene Yellow-Green Fluorescent Particles | Magsphere | PSF-010UM | Fluorescent beads |
| Phantom Miro | Vision Research | Miro M310 | High speed camera |
| Micropump | Cole-Parmer | 81101 | Recirculating pump |
| Leica DM2000 | Leica Microsystems | DM2000 | Fluorescent Microscope |
| Leica 10X Objective | Leica Microsystems | 506259 | Objective for perforator |
| Leica 2.5X Objective | Leica Microsystems | 11506083 | Objective aneurysm sac |
| Leica Blue Filter Cube L5 | Leica Microsystems | 513840 | Blue filter cube |
| Leica EL6000 | Leica Microsystems | 11504115 | Light source |
| Alconox | Alconox Inc | 1104-1 | Detergent |
| ImageJ | NIH | N/A | Open source image analysis software https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Particle Image Velocimetry PIV Plugin | Qingson Tseng | N/A | https://sites.google.com/site/qingzongtseng/piv |
References
- Grant, I. Particle image velocimetry: A review. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part C: Journal of Mechanical Engineering Science. 211 (1), 55-76 (1997).
- Lindken, R., Rossi, M., Große, S., Westerweel, J. Micro-Particle Image Velocimetry (µPIV): Recent developments, applications, and guidelines. Lab on a Chip. 9 (17), 2551 (2009).
- Hove, J. R., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421, 172 (2003).
- Ando, J., Yamamoto, K. Vascular Mechanobiology. Circulation Journal. 73 (11), 1983-1992 (2009).
- Conway, D. E., et al. Fluid Shear Stress on Endothelial Cells Modulates Mechanical Tension across VE-Cadherin and PECAM-1. Current Biology. 23 (11), (2013).
- Kuhlencordt, P. J., et al. Accelerated Atherosclerosis, Aortic Aneurysm Formation, and Ischemic Heart Disease in Apolipoprotein E/Endothelial Nitric Oxide Synthase Double-Knockout Mice. Circulation. 104 (4), 448-454 (2001).
- Lieber, B. B., Stancampiano, A. P., Wakhloo, A. K. Alteration of hemodynamics in aneurysm models by stenting: Influence of stent porosity. Annals of Biomedical Engineering. 25 (3), 460-469 (1997).
- Bulusu, K. V., Plesniak, M. W. Experimental Investigation of Secondary Flow Structures Downstream of a Model Type IV Stent Failure in a 180° Curved Artery Test Section. Journal of Visualized Experiments. (113), e51288 (2016).
- Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1506-1511 (2012).
- Shavit, U., Lowe, R. J., Steinbuck, J. V. Intensity Capping: a simple method to improve cross-correlation PIV results. Experiments in Fluids. 42 (2), 225-240 (2007).
- Raffel, M., Willert, C. E., Werely, S., Kompenhans, J. . Particle Image Velocimetry: a Practical Guide. , (2007).
- Kerl, H. U., et al. Implantation of Pipeline Flow-Diverting Stents Reduces Aneurysm Inflow Without Relevantly Affecting Static Intra-aneurysmal Pressure. Neurosurgery. 74 (3), 321-334 (2014).
- Lieber, B. B., Livescu, V., Hopkins, L. N., Wakhloo, A. K. Particle Image Velocimetry Assessment of Stent Design Influence on Intra-Aneurysmal Flow. Annals of Biomedical Engineering. 30 (6), 768-777 (2002).
- Charonko, J., Karri, S., Schmieg, J., Prabhu, S., Vlachos, P. In vitro, time-resolved PIV comparison of the effect of stent design on wall shear stress. Annals of Biomedical Engineering. 37 (7), 1310-1321 (2009).
- Rand, P. W., Lacombe, E., Hunt, H. E., Austin, W. H. Viscosity of normal human blood under normothermic and hypothermic conditions. Journal of Applied Physiology. 19 (1), 117-122 (1964).
- Kenner, T., Leopold, H., Hinghofer-Szalkay, H. The continuous high-precision measurement of the density of flowing blood. Pflügers Archiv European Journal of Physiology. 370 (1), 25-29 (1977).
- Hoyt, L. F. New Table of the Refractive Index of Pure Glycerol at 20°C. Industrial & Engineering Chemistry. 26 (3), 329-332 (1934).
- Cai, Z., Qiu, W., Shao, G., Wang, W. A new fabrication method for all-PDMS waveguides. Sensors and Actuators A: Physical. 204, 44-47 (2013).
- Bouillot, P., et al. Particle imaging velocimetry evaluation of intracranial stents in sidewall aneurysm: hemodynamic transition related to the stent design. PloS ONE. 9 (12), 113762 (2014).
- Trager, A. L., Sadasivan, C., Lieber, B. B. Comparison of the in vitro hemodynamic performance of new flow diverters for bypass of brain aneurysms. Journal of Biomechanical Engineering. 134 (8), 084505 (2012).
- Clauser, J., et al. A Novel Plasma-Based Fluid for Particle Image Velocimetry (PIV): In-Vitro Feasibility Study of Flow Diverter Effects in Aneurysm Model. Annals of Biomedical Engineering. 46 (6), 841-848 (2018).
- Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).
- Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. Solvent Compatibility of Poly(dimethylsiloxane)-Based Microfluidic Devices. Analytical Chemistry. 75 (23), 6544-6554 (2003).
- Meinhart, C. D., Wereley, S. T., Santiago, J. G. A PIV Algorithm for Estimating Time-Averaged Velocity Fields. Journal of Fluids Engineering. 122 (2), 285 (2000).
- Bosbach, J., Kühn, M., Wagner, C., Raffel, M., Resagk, C. Large-Scale Particle Image Velocimetry of Natural and Mixed Convection. 13th Int Symp on Applications of Laser Techniques to Fluid Mechanics. , (2006).
- Meinhart, C. D., Wereley, S. T., Santiago, J. G. PIV measurements of a microchannel flow. Experiments in Fluids. 27 (5), 414-419 (1999).
- Lima, R., et al. In vitro blood flow in a rectangular PDMS microchannel: experimental observations using a confocal micro-PIV system. Biomedical Microdevices. 10 (2), 153-167 (2008).
- Kuo, C. -. C., Mao, R. -. C. Development of a Precision Surface Polishing System for Parts Fabricated by Fused Deposition Modeling. Materials and Manufacturing Processes. 31 (8), 1113-1118 (2016).
- Kang, K., Oh, S., Yi, H., Han, S., Hwang, Y. Fabrication of truly 3D microfluidic channel using 3D-printed soluble mold. Biomicrofluidics. 12 (1), 014105 (2018).
- Prasad, A. K. Particle Image Velocimetry. Current Science. 79 (1), 51-60 (2000).
- Dellenback, P. A., Macharivilakathu, J., Pierce, S. R. Contrast-enhancement techniques for particle-image velocimetry. Applied Optics. 39 (32), 5978-5990 (2000).
- Cowen, E. A., Monismith, S. G. A hybrid digital particle tracking velocimetry technique. Experiments in Fluids. 22 (3), 199-211 (1997).
- Gruen, A. W. Adaptive least squares correlation: a powerful image matching technique. South African Journal of Photogrammetry, Remote Sensing and Cartography. 14 (3), 175-187 (1985).
- Nogueira, J., Lecuona, A., Rodríguez, P. A. Data validation, false vectors correction and derived magnitudes calculation on PIV data. Measurement Science and Technology. 8 (12), 1493-1501 (1997).
- Loudon, C., Tordesillas, A. The Use of the Dimensionless Womersley Number to Characterize the Unsteady Nature of Internal Flow. Journal of Theoretical Biology. 191 (1), 63-78 (1998).
- Drost, S., De Kruif, B. J., Newport, D. Arduino control of a pulsatile flow rig. Medical Engineering and Physics. 51, 67-71 (2017).
- Tsai, W., Savaş, &. #. 2. 1. 4. ;. Flow pumping system for physiological waveforms. Medical & Biological Engineering & Computing. 48 (2), 197-201 (2010).
- Kato, T., et al. Contrast-enhanced 2D cine phase MR angiography for measurement of basilar artery blood flow in posterior circulation ischemia. American Journal of Neuroradiology. 23 (8), 1346-1351 (2002).
