Meso-skala partikkel bilde Velocimetry studier av nevrovaskulære flyter i Vitro
Summary
Her presenterer vi forenklet metoder for fabrikasjon gjennomsiktig nevrovaskulære fantomer og karakterisere flyten der. Vi markere flere viktige parametere og demonstrere deres forhold til feltet nøyaktighet.
Abstract
Partikkel bilde velocimetry (PIV) brukes i en rekke felt, på grunn av muligheten den gir nøyaktig visualisere og kvantifisere flyter over et stort spatiotemporal spekter. Men krever gjennomføringen vanligvis bruk av dyre og spesialiserte instrumentering, som begrenser nytteverdien bredere. Videre innen bioteknologi, i vitro flyt visualisering studier er også ofte videre begrenset av de høye kostnadene ved kommersielt Hentet vev phantoms som recapitulate ønsket anatomiske strukturer, spesielt for de som span mesoscale regimet (dvs., submillimeter i millimeter lengde skaleringer). Her presenterer vi en forenklet eksperimentelle protokoll utviklet for å håndtere disse begrensningene, de viktigste elementene som inneholder 1) en relativt rimelig metode for fabrikasjon mesoscale vev fantomer 3D utskrift og silikon støping, og 2) en åpen kildekode image bearbeiding ramme som reduserer etterspørsel på instrumenter for å måle mesoscale renn (dvs, hastigheter opp til ti millimeter/sekund). Samlet senker dette barrieren til oppføring på nonexperts, ved å utnytte ressursene som allerede mange bioteknologi forskere. Vi demonstratethe anvendelse av denne protokollen innen rammen av nevrovaskulære flyt karakterisering; men er det forventet å være relevante til et bredere utvalg av mesoscale programmer i bioteknologi og utover.
Introduction
PIV er mye brukt i eksperimentell væske mekanikk for flyt visualisering og kvantitative undersøkelser av jevne bevegelser som varierer i lengde skala fra atmosfærisk microcirculatory renn1,2,3. Mens spesifikk av gjennomføringen kan variere så vidt som sin programmer, er et aspekt felles for nesten alle PIV studier bruk av video tenkelig tracer partikler seeded innen arbeider væsken, etterfulgt av en pair-wise analyse av påfølgende rammer trekke ut ønsket flyt. Vanligvis gjøres dette ved første subdividing hvert bilde i mindre regioner kalt avhør windows. Av tilfeldig plasseringen av spredt partikler inneholder hver avhør-vinduet en unik fordeling av pixel intensiteter. Hvis vinduet størrelse og data oppkjøpet prisen blir valgt riktig, kan cross-korrelasjon av intensitet signalet i hvert vindu brukes til å beregne gjennomsnittlig forskyvning i regionen. Til slutt, gitt at forstørrelsen og bildefrekvens er kjent eksperimentelle parametere, en øyeblikkelig hastighet vektor feltet kan lett beregnes.
En stor fordel med PIV over ett-punkts måling teknikker er dens evne til å tilordne vektorfelt over et to – eller tre – dimensjonale domene. Hemodynamic programmer, spesielt har dratt nytte av denne funksjonen, siden det gir en grundig undersøkelse av lokale renn, som er kjent for å spille en betydelig rolle i vaskulær sykdom eller remodeling (f.eks, atherosclerosis, angiogenese) 4 , 5 , 6. Dette er også sant for vurdering av nevrovaskulære flyter, og samspillet av med endovascular enheter (f.eksflyt avledere stents, intrasaccular spoler), siden relevante lengde-vekter i slike programmer kan går over ofte én eller flere størrelsesordener (f.eksfra mikrometer å millimeter) og enheten geometri og plassering kan betydelig påvirke det lokale væske mekanikk7.
De fleste grupper gjennomføre PIV-baserte hemodynamic studier har stolt på eksperimentell set-ups som nærmere etterligner noen av tidligste undersøkelser stent innflytelse på vaskulær flyt7,8. Vanligvis disse inkluderer en) pulserende lasere og høyhastighets kameraer, å fange høy hastighet renn; b) synkroniseringsenheter, for å hindre aliasing mellom puls frekvensen av laser og kameraet oppkjøpet Rammehastigheten; c) sylindriske optikk, å danne et lys ark, og dermed redusere bakgrunnen fluorescens fra tracer partikler over og under forhør flyet; d) i tilfelle av kommersielle nøkkelferdige systemer, proprietær programvarepakker å utføre cross-korrelasjon-analyser. Men mens noen programmer krever ytelse og/eller allsidighet kollektivt by av disse komponentene, mange andre ikke. Videre de høye kostnadene av kommersielt Hentet vev phantoms som recapitulate ønsket vaskulære strukturer kan også bevise begrense for mange i vitro studier, spesielt for fantomer med har denne broen mesoscale regimet (> 500 USD / Phantom). Her rapporterer vi utviklingen av en forenklet protokoll for implementering PIV for i vitro visualisering nevrovaskulære flyter, som vanligvis ligger begge romlig og timelig mesoscale regimet (dvs.lengde skalaer spenner fra submillimeter til millimeter og hastigheter opptil ti millimeter/sekund). Protokollen søker å utnytte ressursene som allerede mange bioteknologi forskere, således nedsetter barrieren til oppføring for nonexperts.
Det første elementet i denne protokollen innebærer bruk av en investering støping teknikk å aktivere huset fabrikasjon av gjennomsiktig, polydimethylsiloxane (PDMS)-basert vev fantomer fra 3-D-trykt oppofrende former. Ved å utnytte den økende tilgjengeligheten av 3D-skrivere de siste årene, spesielt de i delte/multi-End-User fasiliteter (f.eks, institusjonelle fasiliteter eller offentlig makerspaces), denne metoden reduserer kostnadene betydelig (f.eks< 100 USD/phantom i tilfellet her), mens en rask behandlingstid til fabrikasjon av et bredt utvalg av design og geometri. I den gjeldende protokollen, en smeltet deponering modellering systemet brukes med akrylonitril butadien styren (ABS) som byggematerialet og den utskrevne delen fungerer som en oppofrende mold for påfølgende phantom støping. Vår erfaring har vist at ABS er godt egnet til slik bruk siden det er løselig i vanlige løsemidler (f.eks, aceton), og det har nok styrke og stivhet å opprettholde mold integritet etter fjerning av støtte materiale (f.eks, til hindre deformasjon eller brudd av diminutiv mold). I gjeldende protokollen, er mold integritet ytterligere sikret med solid trykte modeller, selv om dette kommer på bekostning av økt oppløsning tid. Bruk av hul modeller kan også være mulig i noen tilfeller, å forbedre løsemiddel tilgang og dermed redusere oppløsningen. Imidlertid nøye vurdere effekt dette kan ha på mold integritet. Til slutt, mens fantomer fabrikkert her er basert på idealiserte representasjoner av nevrovaskulære strukturer generert ved hjelp av en vanlig programvarepakke for dataassistert konstruksjon (CAD), protokollen er forventet å være mottakelig for fabrikasjon av mer komplekse , pasient-spesifikke geometrier også (f.eks via bruk av modell filer generert av konvertering av kliniske bildebehandling data til den. STL-filformatet som brukes av de fleste 3D-skrivere). Ytterligere detaljer om phantom fabrikasjon prosessen er gitt i § 2 i protokollen.
Det andre elementet i protokollen innebærer bruk av en åpen-kildekode plug-in for ImageJ å utføre cross-korrelasjon analyser9. Dette er kombinert med implementering av en enkel statistisk terskelverdi ordningen (dvs., intensitet capping)10 å forbedre bildet signal før kryss-sammenheng, samt en postcorrelation vektor validering ordningen, den normaliserte Median test (NMT), å eliminere falske vektorer gjennom en sammenligning av sine nærmeste naboer11. Kollektivt, kan å være dyktig til å bruke utstyr som vanligvis finnes i mange bioteknologi laboratorier, dermed eliminere behovet for oppkjøpet av mange av de kostbare komponentene av typiske PIV systemer (f.eks, pulsed laser, Synkroniseringsenheten, sylindriske optikk og proprietær programvare). Ytterligere detaljer angående videosamlingen, bildebehandling og analyse er gitt i avsnitt 5 og 6 av protokollen.
Figur 1 illustrerer PIV-oppsett som brukes i denne protokollen, som avhenger fluorescens mikroskop utstyrt med et høyhastighets kamera for bildebehandling, og en ekstern, kontinuerlig hvitt lys kilde (dvs., metall metallhalid lampe) for gjennom objektive volumetrisk belysning. En variabel-trinns gear pumpe brukes å innføre resirkulerende flyten av en gjennomsiktig narr blod løsning gjennom nevrovaskulære vev fantomer. Løsningen består av en 60: 40 blanding av deionisert (DI) vann og glyserol, som er en vanlig erstatning for blod i hemodynamic studier12,13,14, skyldes en) den samme tetthet og viskositet (dvs. 1,080 kg/m3 og 3,5 cP vs 1050 kg/m3 og 3-5 cP for blod)15,16; b) sin åpenhet i det synlige området; c) det lignende brytningsindeks som PDMS (1,38 vs 1.42 for PDMS)17,18,19,20, som minimerer optisk forvrengning; d) enkel som ikke-newtonsk atferd kan innføres, eventuelt via tillegg av xanthane21. Til slutt, fluorescerende polystyren perler brukes som tracer partikler (10.3 µm i diameter, 480 nm/501 nm eksitasjon/utslipp). Mens nøytralt oppe perler er ønskelig, kan sourcing tracer partikler med optimal væske mekaniske egenskaper (f.eks, tetthet, størrelse, sammensetning) og utslipp bølgelengde være utfordrende. For eksempel, er perler brukt her litt mindre tett enn glyserol løsningen (1050 kg/m3 vs 1,080 kg/m3). Men etter effekten, derav, er ubetydelig, gitt at varigheten av en typisk eksperiment er langt kortere enn tidsskalaen tilknyttet oppdrift effekter (dvs., 5 min og 20 min, henholdsvis). Ytterligere er detaljer om mock blod løsning formulering og i vitro sirkulasjonssystemet opplegget gitt i avsnitt 3 og 4 av protokollen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen beskrevet her skisserer en forenklet metode for å utføre PIV studier for å visualisere nevrovaskulære renner fysiologisk relevante dimensjonene og flyt forhold i vitro. Dermed tjener det til å utfylle protokoller rapportert av andre som har også fokusert på å forenkle kvantifiseringen på vektorfelt, men innenfor svært forskjellige sammenhenger som krever vurdering av langt større lengde skalerer25 eller nederste priser26,<sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne bekrefter delvis støtte til dette prosjektet leveres av samarbeidsprosjekter frø stipend fra Office for forskning og økonomisk utvikling ved UC Riverside.
Materials
| Solidworks 2015 | Dassault Systems | N/A | CAD Software |
| Dow Corning Sylgard 184 Kit | Ellsworth Adhesive | 184 SIL ELAST KIT 3.9KG | PDMS Kit |
| Stratasys Dimension Elite | Stratasys | 9180-00105 | 3D printer |
| P430 Model Material Cartridge | Stratasys | 340-21202 | ABS build material |
| P400 SR Soluble Support Material Cartridge | Stratasys | 340-30200 | Support material |
| CleanStation DT3 | PM3 Technologies | 00-00300R | Base bath |
| Lindberg Blue M LGO Box Furnace | Thermo Scientific | LB305745M | Oven |
| 21G BD PrecisionGlide Needle | Betcon Dickenson | BD 305167 | Branching perforator mold segment |
| Desiccator (Vacuum) | Polylab | 55205 | Desiccator |
| Branson 1800 Utrasonic Cleaning | Branson | CPX-952-116R | Sonicator |
| Acetone | Fisher Chemical | A9494 | Acetone |
| Isopropol Alcohol | Fisher Chemical | A4514 | Isopropol Alcohol |
| Glycerol | Fisher Chemical | GW33500 | Glycerol |
| 10um Polystyrene Yellow-Green Fluorescent Particles | Magsphere | PSF-010UM | Fluorescent beads |
| Phantom Miro | Vision Research | Miro M310 | High speed camera |
| Micropump | Cole-Parmer | 81101 | Recirculating pump |
| Leica DM2000 | Leica Microsystems | DM2000 | Fluorescent Microscope |
| Leica 10X Objective | Leica Microsystems | 506259 | Objective for perforator |
| Leica 2.5X Objective | Leica Microsystems | 11506083 | Objective aneurysm sac |
| Leica Blue Filter Cube L5 | Leica Microsystems | 513840 | Blue filter cube |
| Leica EL6000 | Leica Microsystems | 11504115 | Light source |
| Alconox | Alconox Inc | 1104-1 | Detergent |
| ImageJ | NIH | N/A | Open source image analysis software https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Particle Image Velocimetry PIV Plugin | Qingson Tseng | N/A | https://sites.google.com/site/qingzongtseng/piv |
References
- Grant, I. Particle image velocimetry: A review. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part C: Journal of Mechanical Engineering Science. 211 (1), 55-76 (1997).
- Lindken, R., Rossi, M., Große, S., Westerweel, J. Micro-Particle Image Velocimetry (µPIV): Recent developments, applications, and guidelines. Lab on a Chip. 9 (17), 2551 (2009).
- Hove, J. R., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421, 172 (2003).
- Ando, J., Yamamoto, K. Vascular Mechanobiology. Circulation Journal. 73 (11), 1983-1992 (2009).
- Conway, D. E., et al. Fluid Shear Stress on Endothelial Cells Modulates Mechanical Tension across VE-Cadherin and PECAM-1. Current Biology. 23 (11), (2013).
- Kuhlencordt, P. J., et al. Accelerated Atherosclerosis, Aortic Aneurysm Formation, and Ischemic Heart Disease in Apolipoprotein E/Endothelial Nitric Oxide Synthase Double-Knockout Mice. Circulation. 104 (4), 448-454 (2001).
- Lieber, B. B., Stancampiano, A. P., Wakhloo, A. K. Alteration of hemodynamics in aneurysm models by stenting: Influence of stent porosity. Annals of Biomedical Engineering. 25 (3), 460-469 (1997).
- Bulusu, K. V., Plesniak, M. W. Experimental Investigation of Secondary Flow Structures Downstream of a Model Type IV Stent Failure in a 180° Curved Artery Test Section. Journal of Visualized Experiments. (113), e51288 (2016).
- Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1506-1511 (2012).
- Shavit, U., Lowe, R. J., Steinbuck, J. V. Intensity Capping: a simple method to improve cross-correlation PIV results. Experiments in Fluids. 42 (2), 225-240 (2007).
- Raffel, M., Willert, C. E., Werely, S., Kompenhans, J. . Particle Image Velocimetry: a Practical Guide. , (2007).
- Kerl, H. U., et al. Implantation of Pipeline Flow-Diverting Stents Reduces Aneurysm Inflow Without Relevantly Affecting Static Intra-aneurysmal Pressure. Neurosurgery. 74 (3), 321-334 (2014).
- Lieber, B. B., Livescu, V., Hopkins, L. N., Wakhloo, A. K. Particle Image Velocimetry Assessment of Stent Design Influence on Intra-Aneurysmal Flow. Annals of Biomedical Engineering. 30 (6), 768-777 (2002).
- Charonko, J., Karri, S., Schmieg, J., Prabhu, S., Vlachos, P. In vitro, time-resolved PIV comparison of the effect of stent design on wall shear stress. Annals of Biomedical Engineering. 37 (7), 1310-1321 (2009).
- Rand, P. W., Lacombe, E., Hunt, H. E., Austin, W. H. Viscosity of normal human blood under normothermic and hypothermic conditions. Journal of Applied Physiology. 19 (1), 117-122 (1964).
- Kenner, T., Leopold, H., Hinghofer-Szalkay, H. The continuous high-precision measurement of the density of flowing blood. Pflügers Archiv European Journal of Physiology. 370 (1), 25-29 (1977).
- Hoyt, L. F. New Table of the Refractive Index of Pure Glycerol at 20°C. Industrial & Engineering Chemistry. 26 (3), 329-332 (1934).
- Cai, Z., Qiu, W., Shao, G., Wang, W. A new fabrication method for all-PDMS waveguides. Sensors and Actuators A: Physical. 204, 44-47 (2013).
- Bouillot, P., et al. Particle imaging velocimetry evaluation of intracranial stents in sidewall aneurysm: hemodynamic transition related to the stent design. PloS ONE. 9 (12), 113762 (2014).
- Trager, A. L., Sadasivan, C., Lieber, B. B. Comparison of the in vitro hemodynamic performance of new flow diverters for bypass of brain aneurysms. Journal of Biomechanical Engineering. 134 (8), 084505 (2012).
- Clauser, J., et al. A Novel Plasma-Based Fluid for Particle Image Velocimetry (PIV): In-Vitro Feasibility Study of Flow Diverter Effects in Aneurysm Model. Annals of Biomedical Engineering. 46 (6), 841-848 (2018).
- Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).
- Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. Solvent Compatibility of Poly(dimethylsiloxane)-Based Microfluidic Devices. Analytical Chemistry. 75 (23), 6544-6554 (2003).
- Meinhart, C. D., Wereley, S. T., Santiago, J. G. A PIV Algorithm for Estimating Time-Averaged Velocity Fields. Journal of Fluids Engineering. 122 (2), 285 (2000).
- Bosbach, J., Kühn, M., Wagner, C., Raffel, M., Resagk, C. Large-Scale Particle Image Velocimetry of Natural and Mixed Convection. 13th Int Symp on Applications of Laser Techniques to Fluid Mechanics. , (2006).
- Meinhart, C. D., Wereley, S. T., Santiago, J. G. PIV measurements of a microchannel flow. Experiments in Fluids. 27 (5), 414-419 (1999).
- Lima, R., et al. In vitro blood flow in a rectangular PDMS microchannel: experimental observations using a confocal micro-PIV system. Biomedical Microdevices. 10 (2), 153-167 (2008).
- Kuo, C. -. C., Mao, R. -. C. Development of a Precision Surface Polishing System for Parts Fabricated by Fused Deposition Modeling. Materials and Manufacturing Processes. 31 (8), 1113-1118 (2016).
- Kang, K., Oh, S., Yi, H., Han, S., Hwang, Y. Fabrication of truly 3D microfluidic channel using 3D-printed soluble mold. Biomicrofluidics. 12 (1), 014105 (2018).
- Prasad, A. K. Particle Image Velocimetry. Current Science. 79 (1), 51-60 (2000).
- Dellenback, P. A., Macharivilakathu, J., Pierce, S. R. Contrast-enhancement techniques for particle-image velocimetry. Applied Optics. 39 (32), 5978-5990 (2000).
- Cowen, E. A., Monismith, S. G. A hybrid digital particle tracking velocimetry technique. Experiments in Fluids. 22 (3), 199-211 (1997).
- Gruen, A. W. Adaptive least squares correlation: a powerful image matching technique. South African Journal of Photogrammetry, Remote Sensing and Cartography. 14 (3), 175-187 (1985).
- Nogueira, J., Lecuona, A., Rodríguez, P. A. Data validation, false vectors correction and derived magnitudes calculation on PIV data. Measurement Science and Technology. 8 (12), 1493-1501 (1997).
- Loudon, C., Tordesillas, A. The Use of the Dimensionless Womersley Number to Characterize the Unsteady Nature of Internal Flow. Journal of Theoretical Biology. 191 (1), 63-78 (1998).
- Drost, S., De Kruif, B. J., Newport, D. Arduino control of a pulsatile flow rig. Medical Engineering and Physics. 51, 67-71 (2017).
- Tsai, W., Savaş, &. #. 2. 1. 4. ;. Flow pumping system for physiological waveforms. Medical & Biological Engineering & Computing. 48 (2), 197-201 (2010).
- Kato, T., et al. Contrast-enhanced 2D cine phase MR angiography for measurement of basilar artery blood flow in posterior circulation ischemia. American Journal of Neuroradiology. 23 (8), 1346-1351 (2002).
