Bio-Energetik utredning av Candida albicans använder Real-time extracellulära Flux analys
Summary
Här presenterar vi ett stegvis protokoll för att undersöka den mitokondriella respiration och glycolytic funktion i Candida Albicans använder en extra flux analysator.
Abstract
Mitokondrierna är väsentliga organeller för cellulär metabolism och överlevnad. En mängd viktiga händelser sker i mitokondrierna, såsom cellandningen, oxidativ metabolism, signaltransduktion och apoptos. Mitokondriell dysfunktion rapporteras därför spela en viktig roll i svampdödande läkemedel tolerans och virulens sjukdomsalstrande svampar. Senaste data har också lett till ett erkännande av betydelsen av mitokondrierna som en viktig bidragsgivare till svamp patogenes. Trots betydelsen av mitokondrierna i svamp biologi, är standardiserade metoder för att förstå dess funktion dåligt utvecklade. Här presenterar vi ett förfarande för att studera basala syre materialåtgången (OCR), ett mått på mitokondriell respiration och extracellulära försurning priser (ECAR), ett mått på glycolytic funktion i C. albicans stammar. Den metod som beskrivs häri kan tillämpas på någon Candidaspp. stammar utan att behöva rena mitokondrier från intakt svamp cellerna. Dessutom detta protokoll kan också anpassas till skärmen för hämmare av mitokondriell funktion i C. albicans stammar.
Introduction
Invasiva svampinfektioner döda över 1,5 miljoner människor per år i hela världen. Detta nummer är på uppgång på grund av en ökning i antalet personer som lever med nedsatt immunitet, inklusive äldre, prematura spädbarn, transplantation mottagare och cancer patienter1. C. albicans är en opportunistisk mänsklig svamp patogener som är en del av den mänskliga mikrofloran. Den lever också slemhinnor och mag-tarmkanalen som kommensaler organism. C. albicans producerar allvarliga systemisk sjukdom hos personer som har immunbrister, som har genomgått en operation, eller som har behandlats med långa kurser av antibiotika. Candida arter rang bland topp tre till fyra orsakar av nosokomiala infektionssjukdomar (NID) i människor2,3,4,5,6,7. Av Candida infektioner blodomloppet årliga antalet uppskattas vara ~ 400 000 fall, med tillhörande mortaliteten 46-75%1. Den årliga dödligheten på grund av candidiasis är ungefär 10 000 i USA ensam. Omfattningen av NID orsakade av svamp återspeglas också i astronomiska patientens kostnader5. I USA överträffar den årliga kostnaden för behandling av invasiva svampinfektioner 2 miljarder dollar, att lägga till en enorm påfrestning för redan överbelastade hälso-och sjukvården. För närvarande är tillgängliga standard antimykotiska behandlingar begränsad på grund av toxicitet, allt vanligare läkemedelsresistens och läkemedelsinteraktioner. Därför finns det ett brådskande behov att identifiera nya svampdödande målmolekyler som resulterar i bättre behandlingsalternativ för patienter med hög risk. Upptäckten av nya läkemedel som agerar på svamp mål är emellertid komplicerat eftersom svampar är eukaryota organismer. Detta begränsar kraftigt antalet svamp-specifika målmolekyler.
Nyligen genomförda studier har visat att mitokondrierna är en viktig bidragsgivare till svamp virulens och tolerans mot svampdödande läkemedel eftersom mitokondrierna är viktiga för cellandningen, oxidativ metabolism, signaltransduktion och apoptos8 ,9,10,11. Glycolytic såväl som icke-glycolytic metabolism är avgörande för överlevnaden av C. albicans i däggdjur värd12,13,14,15,16. Dessutom har flera C. albicans mutanter saknar mitokondrie proteiner, såsom Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 etc. visat sig vara defekt i filamentation, en viktig virulens faktor C. albicans17, 18 , 19 , 20 , 21 , 22. Dessutom dessa mutanter visades också att mildras för virulens i en musmodell av disseminerad candidiasis17,18,19,20,21 ,22. Sålunda, svamp mitokondrier representerar ett attraktivt mål för läkemedelsutveckling. Studien av mitokondriell funktion i C. albicans är dock en utmaning eftersom C. albicans är petite negativa23, vilket innebär att det inte kan överleva utan det mitokondriella genomet.
Här beskriver vi ett protokoll som kan användas för att undersöka mitokondrie och glycolytic funktion i C. albicans utan att behöva rena mitokondrier. Denna metod kan också optimeras för att undersöka effekten av genetisk manipulation eller kemiska modulatorer på mitokondriella och glycolytic vägar i C. albicans.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bioenergetik extra flux assay fungerar som ett utmärkt verktyg att läsa ut mitokondriefunktion genom att mäta oxidativ fosforylering (OXPHOS)-beroende syreförbrukning i realtid. Dessutom kan en glycolytic funktion som är mätt som årstakt extracellulära försurning (förändring av extracellulära pH) också undersökas samtidigt i realtid analys.
Framgångsrika plätering av C. albicans i assay plattan är en av de kritiska steg i analysen eftersom inkubering av cellerna i PDL…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning i NC lab stöds av National Institutes of Health (NIH) bidrag R01AI24499 och en New Jersey Health Foundation (NJHF) grant, #PC40-18.
Materials
| RPMI 1640 | Corning | MT50020PB | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| KCN | |||
| Mito stress kit | Agilent | 103015-100 | |
| Oligomycin | Calbiochem | 495455 | |
| pH meter | Accumet | AR20 | |
| Phenol red | Sigma | P5530 | |
| Poly-D lysine | Sigma | P6407 | |
| Rotenone | Santa cruz | 203242 | |
| Seahorse XF24 FluxPak | Agilent | 100850-001 | |
| SHAM | |||
| Sodium Chloride | Amresco | 241 | |
| Sodium hydroxie pellets | J.T Baker | 3722 | |
| Tissue culture grade water | Gibco | 1523-0147 | |
| XF assay calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose | Fisher scientific, | BP2469 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose Agar | Sigma | A1296 | |
| Yeast extract Peptone Glycerol | Sigma | G2025 |
References
- Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).
- Ascioglu, S., et al. Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus. Clinical Infectious Diseases. 34 (1), 7-14 (2002).
- Stover, B. H., et al. Nosocomial infection rates in US children’s hospitals’ neonatal and pediatric intensive care units. American Journal of Infection Control. 29 (3), 152-157 (2001).
- Wilson, L. S., et al. The direct cost and incidence of systemic fungal infections. Value in Health. 5 (1), 26-34 (2002).
- Wenzel, R. P. Nosocomial candidemia: risk factors and attributable mortality. Clinical Infectious Diseases. 20 (6), 1531-1534 (1995).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in pediatric patients in United States hospitals: epidemiology, clinical features and susceptibilities. Pediatric Infectious Disease Journal. 22 (8), 686-691 (2003).
- Cheng, W. C., Leach, K. M., Hardwick, J. M. Mitochondrial death pathways in yeast and mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (7), 1272-1279 (2008).
- Shingu-Vazquez, M., Traven, A. Mitochondria and fungal pathogenesis: drug tolerance, virulence, and potential for antifungal therapy. Eukaryotic Cell. 10 (11), 1376-1383 (2011).
- Brown, A. J., Brown, G. D., Netea, M. G., Gow, N. A. Metabolism impacts upon Candida immunogenicity and pathogenicity at multiple levels. Trends in Microbiology. 22 (11), 614-622 (2014).
- Tucey, T. M., et al. Glucose Homeostasis Is Important for Immune Cell Viability during Candida Challenge and Host Survival of Systemic Fungal Infection. Cell Metabolism. 27 (5), 988-1006 (2018).
- Barelle, C. J., et al. Niche-specific regulation of central metabolic pathways in a fungal pathogen. Cellular Microbiology. 8 (6), 961-971 (2006).
- Carman, A. J., Vylkova, S., Lorenz, M. C. Role of acetyl coenzyme A synthesis and breakdown in alternative carbon source utilization in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 7 (10), 1733-1741 (2008).
- Fradin, C., et al. Granulocytes govern the transcriptional response, morphology and proliferation of Candida albicans in human blood. Molecular Microbiology. 56 (2), 397-415 (2005).
- Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages. Eukaryotic Cell. 3 (5), 1076-1087 (2004).
- Ramirez, M. A., Lorenz, M. C. Mutations in alternative carbon utilization pathways in Candida albicans attenuate virulence and confer pleiotropic phenotypes. Eukaryotic Cell. 6 (2), 280-290 (2007).
- Bambach, A., et al. Goa1p of Candida albicans localizes to the mitochondria during stress and is required for mitochondrial function and virulence. Eukaryotic Cell. 8 (11), 1706-1720 (2009).
- Li, D., et al. Enzymatic dysfunction of mitochondrial complex I of the Candida albicans goa1 mutant is associated with increased reactive oxidants and cell death. Eukaryotic Cell. 10 (5), 672-682 (2011).
- Desai, C., Mavrianos, J., Chauhan, N. Candida albicans SRR1, a putative two-component response regulator gene, is required for stress adaptation, morphogenesis, and virulence. Eukaryotic Cell. 10 (10), 1370-1374 (2011).
- Mavrianos, J., et al. Mitochondrial two-component signaling systems in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 12 (6), 913-922 (2013).
- Koch, B., et al. The Mitochondrial GTPase Gem1 Contributes to the Cell Wall Stress Response and Invasive Growth of Candida albicans. Frontiers in Microbiology. 8, 2555 (2017).
- Qu, Y., et al. Mitochondrial sorting and assembly machinery subunit Sam37 in Candida albicans: insight into the roles of mitochondria in fitness, cell wall integrity, and virulence. Eukaryotic Cell. 11 (4), 532-544 (2012).
- Brandt, M. E. . Candida and Candidiasis. , (2002).
- Huh, W. K., Kang, S. O. Molecular cloning and functional expression of alternative oxidase from Candida albicans. Journal of Bacteriology. 181 (13), 4098-4102 (1999).
- Yan, L., et al. The alternative oxidase of Candida albicans causes reduced fluconazole susceptibility. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (4), 764-773 (2009).
- de Moura, M. B., Van Houten, B. Bioenergetic analysis of intact mammalian cells using the Seahorse XF24 Extracellular Flux analyzer and a luciferase ATP assay. Methods in Molecular Biology. 1105, 589-602 (2014).
