Candida एल्बीकांस के जैव-ऊर्जा विज्ञान जांच वास्तविक समय Extracellular फ्लक्स विश्लेषण का उपयोग
Summary
यहाँ, हम एक अतिरिक्त फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग कर candida एल्बिकैंस में mitochondrial श्वसन और glycolytic समारोह की जांच करने के लिए एक पदश: प्रोटोकॉल मौजूद.
Abstract
Mitochondria सेलुलर चयापचय और अस्तित्व के लिए आवश्यक organelles हैं । प्रमुख घटनाओं की एक किस्म माइटोकॉन्ड्रिया में जगह ले, जैसे सेलुलर श्वसन, oxidative चयापचय, संकेत transduction, और apoptosis. फलस्वरूप, रोगजनक कवक के ऐंटिफंगल दवा सहिष्णुता में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए mitochondrial शिथिलता की सूचना है । हाल के डेटा भी कवक रोगजनन के लिए एक महत्वपूर्ण योगदानकर्ता के रूप में mitochondria के महत्व की मांयता के लिए नेतृत्व किया है । कवक जीव विज्ञान में माइटोकोनड्रिया के महत्व के बावजूद, मानकीकृत तरीके से अपने कार्य को समझने के लिए खराब विकसित कर रहे हैं । यहां, हम एक प्रक्रिया के लिए बेसल ऑक्सीजन की खपत दर (OCR), माइटोकॉड्रियल श्वसन का एक उपाय है, और extracellular अडिफिकेशन दर (ECAR), सी. एल्बीकांस उपभेदों में glycolytic समारोह के एक उपाय का अध्ययन प्रस्तुत करते हैं । यहां वर्णित विधि किसी भी Candidaspp. संवेदनहीन को बरकरार कवक कोशिकाओं से mitochondria शुद्ध करने की आवश्यकता के बिना लागू किया जा सकता है । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल भी सी. एल्बिकन उपभेदों में mitochondrial समारोह के inhibitors के लिए स्क्रीन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
Introduction
आक्रामक कवक संक्रमण १,५००,००० लोगों को एक साल दुनिया भर में मार डालो । यह संख्या वृद्धि पर समझौता प्रतिरक्षा के साथ रहने वाले लोगों की संख्या में वृद्धि के कारण है, बुजुर्गों सहित, समयपूर्व शिशुओं, प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं, और कैंसर के रोगियों1। C. albicans एक अवसरवादी मानव कवक रोगज़नक़ है कि मानव माइक्रोफ्लोरा का एक हिस्सा है । यह भी श्लेष्मिक सतहों और एक कोमेंसल जीव के रूप में जठरांत्र संबंधी मार्ग में जलधाराओं । C. एल्बीकांस उन लोगों में गंभीर प्रणालीगत बीमारी पैदा करता है, जिनके पास प्रतिरक्षा की कमी है, जो शल्य चिकित्सा करते हैं, या जो एंटीबायोटिक दवाओं के लंबे पाठ्यक्रमों के साथ इलाज किया गया है । कैंडिडा प्रजातियों मनुष्यों में nosocomial संक्रामक रोगों (एनआईडी) के शीर्ष तीन से चार कारणों में रैंक2,3,4,5,6,7. Candida खून संक्रमण की वार्षिक वैश्विक संख्या का अनुमान है ~ ४००,००० मामलों में, 46-75%1के एसोसिएटेड की शर्तों के साथ । कैंडिडिआसिस की वार्षिक मृत्यु दर लगभग १०,००० संयुक्त राज्य अमेरिका में अकेले है । कवक के कारण एनआईडी की मात्रा भी खगोलीय रोगी व्यय5में परिलक्षित होता है । संयुक्त राज्य अमेरिका में, आक्रामक कवक संक्रमण के उपचार के लिए वार्षिक खर्च $२,०००,०००,००० से बढ़कर, पहले से ही मुलभुत स्वास्थ्य देखभाल प्रणाली के लिए एक बड़ा दबाव जोड़ने । वर्तमान में, उपलब्ध मानक ऐंटिफंगल चिकित्सा क्योंकि विषाक्तता के सीमित हैं, तेजी से प्रचलित दवा प्रतिरोध, और नशीली दवाओं बातचीत । इसलिए, वहां एक तत्काल नए ऐंटिफंगल दवा लक्ष्य है कि उच्च जोखिम वाले रोगियों के लिए बेहतर इलाज के विकल्प में परिणाम होगा की पहचान की जरूरत है । हालांकि, कवक लक्ष्य पर काम कर रहे नई दवाओं की खोज जटिल है क्योंकि कवक यूक्योट्स हैं । यह बहुत कवक विशेष दवा लक्ष्य की संख्या को सीमित करता है ।
हाल के अध्ययनों से संकेत मिला है कि mitochondria कवक और ऐंटिफंगल दवाओं के लिए सहिष्णुता के लिए एक महत्वपूर्ण योगदानकर्ता है mitochondria सेलुलर श्वसन के लिए महत्वपूर्ण हैं, oxidative चयापचय, संकेत transduction, और apoptosis8 ,9,10,11. दोनों glycolytic और गैर glycolytic चयापचय स्तनधारी मेजबान12,13,14,15,16में सी. ऐल्बिकन्स के अस्तित्व के लिए आवश्यक हैं । इसके अलावा, कई सी. ऐल्बिकन म्यूटेंट में माइटोकोड्रियल प्रोटीन की कमी होती है, जैसे कि Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 आदि को फाइलेमेंटेशन में दोषपूर्ण दर्शाया गया है, c. ऐल्बिकन17 का एक महत्वपूर्ण विलक्षणकारी कारक 18 , 19 , 20 , 21 , 22. इसके अलावा, इन म्यूटेंट भी फैलाया कैंडिडिआसिस17,18,19,20,21 के एक माउस मॉडल में विरूंस के लिए क्षीणता दिखाया गया ,22. इस प्रकार, कवक mitochondria दवा की खोज के लिए एक आकर्षक लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करते हैं । हालांकि, सी. एल्बीकेंस में माइटोकोड्रियल फंक्शन का अध्ययन चुनौतीपूर्ण है क्योंकि c. ऐल्बिकेंस पेटिट निगेटिव23है, जिसका मतलब है कि यह माइटोकोड्रियल जीनोम के बिना जीवित नहीं रह सकता ।
यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल है कि माइटोकॉनड्रिया को शुद्ध करने की आवश्यकता के बिना सी. एल्बिकन्स में mitochondrial और glycolytic समारोह की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है का वर्णन. इस विधि के आनुवंशिक हेरफेर या रासायनिक नियन्त्रक के प्रभाव की जांच करने के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है माइटोकॉड्रियल और C. albicansमें glycolytic रास्ते पर ।
Protocol
Representative Results
Discussion
bioenergetics अतिरिक्त फ्लक्स परख एक उत्कृष्ट उपकरण के रूप में कार्य करता है के लिए बाहर oxidative फास्फोरिलेशन (OXPHOS)-वास्तविक समय में निर्भर ऑक्सीजन की खपत को मापने से mitochondrial समारोह पढ़ें । इसके अलावा, एक glycolytic समारोह है ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
नेकां प्रयोगशाला में अनुसंधान स्वास्थ्य के एक राष्ट्रीय संस्थान (NIH) अनुदान R01AI24499 और ंयू जर्सी स्वास्थ्य फाउंडेशन (NJHF) अनुदान, #PC40-18 द्वारा समर्थित है ।
Materials
| RPMI 1640 | Corning | MT50020PB | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| KCN | |||
| Mito stress kit | Agilent | 103015-100 | |
| Oligomycin | Calbiochem | 495455 | |
| pH meter | Accumet | AR20 | |
| Phenol red | Sigma | P5530 | |
| Poly-D lysine | Sigma | P6407 | |
| Rotenone | Santa cruz | 203242 | |
| Seahorse XF24 FluxPak | Agilent | 100850-001 | |
| SHAM | |||
| Sodium Chloride | Amresco | 241 | |
| Sodium hydroxie pellets | J.T Baker | 3722 | |
| Tissue culture grade water | Gibco | 1523-0147 | |
| XF assay calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose | Fisher scientific, | BP2469 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose Agar | Sigma | A1296 | |
| Yeast extract Peptone Glycerol | Sigma | G2025 |
References
- Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).
- Ascioglu, S., et al. Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus. Clinical Infectious Diseases. 34 (1), 7-14 (2002).
- Stover, B. H., et al. Nosocomial infection rates in US children’s hospitals’ neonatal and pediatric intensive care units. American Journal of Infection Control. 29 (3), 152-157 (2001).
- Wilson, L. S., et al. The direct cost and incidence of systemic fungal infections. Value in Health. 5 (1), 26-34 (2002).
- Wenzel, R. P. Nosocomial candidemia: risk factors and attributable mortality. Clinical Infectious Diseases. 20 (6), 1531-1534 (1995).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in pediatric patients in United States hospitals: epidemiology, clinical features and susceptibilities. Pediatric Infectious Disease Journal. 22 (8), 686-691 (2003).
- Cheng, W. C., Leach, K. M., Hardwick, J. M. Mitochondrial death pathways in yeast and mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (7), 1272-1279 (2008).
- Shingu-Vazquez, M., Traven, A. Mitochondria and fungal pathogenesis: drug tolerance, virulence, and potential for antifungal therapy. Eukaryotic Cell. 10 (11), 1376-1383 (2011).
- Brown, A. J., Brown, G. D., Netea, M. G., Gow, N. A. Metabolism impacts upon Candida immunogenicity and pathogenicity at multiple levels. Trends in Microbiology. 22 (11), 614-622 (2014).
- Tucey, T. M., et al. Glucose Homeostasis Is Important for Immune Cell Viability during Candida Challenge and Host Survival of Systemic Fungal Infection. Cell Metabolism. 27 (5), 988-1006 (2018).
- Barelle, C. J., et al. Niche-specific regulation of central metabolic pathways in a fungal pathogen. Cellular Microbiology. 8 (6), 961-971 (2006).
- Carman, A. J., Vylkova, S., Lorenz, M. C. Role of acetyl coenzyme A synthesis and breakdown in alternative carbon source utilization in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 7 (10), 1733-1741 (2008).
- Fradin, C., et al. Granulocytes govern the transcriptional response, morphology and proliferation of Candida albicans in human blood. Molecular Microbiology. 56 (2), 397-415 (2005).
- Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages. Eukaryotic Cell. 3 (5), 1076-1087 (2004).
- Ramirez, M. A., Lorenz, M. C. Mutations in alternative carbon utilization pathways in Candida albicans attenuate virulence and confer pleiotropic phenotypes. Eukaryotic Cell. 6 (2), 280-290 (2007).
- Bambach, A., et al. Goa1p of Candida albicans localizes to the mitochondria during stress and is required for mitochondrial function and virulence. Eukaryotic Cell. 8 (11), 1706-1720 (2009).
- Li, D., et al. Enzymatic dysfunction of mitochondrial complex I of the Candida albicans goa1 mutant is associated with increased reactive oxidants and cell death. Eukaryotic Cell. 10 (5), 672-682 (2011).
- Desai, C., Mavrianos, J., Chauhan, N. Candida albicans SRR1, a putative two-component response regulator gene, is required for stress adaptation, morphogenesis, and virulence. Eukaryotic Cell. 10 (10), 1370-1374 (2011).
- Mavrianos, J., et al. Mitochondrial two-component signaling systems in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 12 (6), 913-922 (2013).
- Koch, B., et al. The Mitochondrial GTPase Gem1 Contributes to the Cell Wall Stress Response and Invasive Growth of Candida albicans. Frontiers in Microbiology. 8, 2555 (2017).
- Qu, Y., et al. Mitochondrial sorting and assembly machinery subunit Sam37 in Candida albicans: insight into the roles of mitochondria in fitness, cell wall integrity, and virulence. Eukaryotic Cell. 11 (4), 532-544 (2012).
- Brandt, M. E. . Candida and Candidiasis. , (2002).
- Huh, W. K., Kang, S. O. Molecular cloning and functional expression of alternative oxidase from Candida albicans. Journal of Bacteriology. 181 (13), 4098-4102 (1999).
- Yan, L., et al. The alternative oxidase of Candida albicans causes reduced fluconazole susceptibility. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (4), 764-773 (2009).
- de Moura, M. B., Van Houten, B. Bioenergetic analysis of intact mammalian cells using the Seahorse XF24 Extracellular Flux analyzer and a luciferase ATP assay. Methods in Molecular Biology. 1105, 589-602 (2014).
