Live celle analyse av skjæring Stress på Pseudomonas aeruginosa bruker en automatisert høyere gjennomstrømming Microfluidic System

Summary

Her beskriver vi bruk av en høyere gjennomstrømming microfluidic bioreactor kombinert med fluorescerende mikroskop for analyse av skjæring stress effekter på Pseudomonas aeruginosa biofilm uttrykke grønne fluorescerende proteiner, inkludert instrument sette opp, bestemmelse av biofilm dekning, vekst og morfologiske egenskaper.

Abstract

En høyere gjennomstrømming microfluidic i vitro bioreactor kombinert med fluorescens mikroskopi er brukt til å studere bakteriell biofilm vekst og morfologi, inkludert Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Her vil vi beskrive hvordan systemet kan brukes til å studere vekst kinetics og morfologiske egenskaper som overflateruhet og tekstur entropi P. aeruginosa belaste PA01 som uttrykker en forbedret grønne fluorescerende protein (PA01-EGFP ). En protokoll som detaljert beskriver hvordan du vokse og frø PA01-EGFP kulturer, hvordan du setter opp mikroskop og autorun, og gjennomføre bildeanalyse for å finne veksten og morfologiske egenskaper ved hjelp av en rekke skjær krefter som styres av den microfluidic enhet. Denne artikkelen gir en detaljert beskrivelse av en teknikk for å forbedre studiet av PA01-EGFP biofilm som til slutt kan brukes mot andre stammer av bakterier, sopp og alger biofilm ved hjelp av microfluidic-plattformen.

Introduction

Her viser vi en metode for å måle effekten av skjæring stress av fluorescerende Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) PA01 biofilm bruker en automatisert høyere gjennomstrømming microfluidic system.

Biofilm er samfunn av mikroorganismer, som bakterier, organisert av en ekstracellulære polymere stoff som er knyttet til en støtte og finnes vanligvis på grensesnittet mellom en væske og en solid overflate¹. Disse biofilm samfunn kan være gunstig for miljøet, som bedre vannkvaliteten i vann- og bioremediation av gjenstridige forbindelser^2,3. Men kan biofilm også være svært skadelig for helse med uønskede konsekvenser. For eksempel er medisinske enheter, for eksempel hofte og kne implantater, en type overflate der biofilm akkumulering har vært en utfordring og forårsaker alvorlige medisinske komplikasjoner^4,5. Biofilm kan også angi naturlige vann systemer, som elver og innsjøer, og infiltrere vannforsyning rør fører til bakterier forurensning i drikkevannet resulterer i infeksjoner^6,7,8. Biofilm dannet marint overholde skip og andre menneskeskapte underlag og presentere et stort økonomisk og miljømessig problem som økt friksjon fører til øke drivstoff forbruk^9,10. Antimikrobielle belegg, som Tributyltin, har blitt utviklet for å hindre at disse problemene, men er giftig for sjøliv¹¹.

P. aeruginosa er en Gram-negative bakterie med høy blomstrende evner i en rekke miljø-og nutrimental¹². P. aeruginosa er en vanlig årsak til samfunnet – og sykehus-infeksjoner ervervet og funnet å være tett knyttet til skader, som alvorlige forbrenninger og immunsupprimerte verter, som i cystisk fibrose (CF)^{5,12, 13}, AIDS og kreft pasienter^5,13. Dannelsen av P. aeruginosa biofilm er mest alvorlig koblet til CF, der kroniske lunge infeksjoner er den ledende dødsårsaken for denne sykdommen⁵.

En referanse stamme av P. aeruginosa, PA01, brukes i denne rapporten og er genetisk modifisert for å uttrykke en forbedret grønne fluorescerende protein (PA-EGFP). EGFP representerer en mutant form for GFP med større fluorescens egenskaper som tillater i situ biofilm analyse med fluorescens mikroskopi^14,15,16. Denne typen fluorescens analyse er fordelaktig for å studere biofilm fordi GFP ikke påvirke betydelig cellevekst og funksjonen¹⁷. For eksempel vokste Escherichia coli cellene som ble merket med GFP også og kontinuerlig uten å ha lidd noen toksiske effekter i forhold til de kontroll bakterier¹⁷. Andre rapporter underbygge denne påstanden^18,19,20. Videre bruk av fluorescerende reporter som EGFP er rask og enkel, men bare lever celler vil bli målt fordi døde celler raskt slutte å fluoresce²¹.

Biofilm kan vokse under ulike miljøforhold, inkludert de med forskjellige strømningshastigheter. For eksempel kan filmer vokse i høy skjæring stress, som i elver, hvor den høy vann strømningsforhold føre til en større mikrobiell mangfold²². Contrarily, stående vann dammer eller muntlig biofilm oppleve en mye lavere skjær force²³. I tillegg til strømningsrate, det er andre faktorer som påvirker biofilm vedheft, inkludert overflateruhet og hydrophobicity, media komposisjon, og selv bakterielle celler overflaten^{1,4,7, 24}. forhold kan også forårsake variasjon i romlig struktur eller morfologi av en biofilm. Dette inkluderer miljøforhold som skjæring stress utøves av en bevegelse væske eller graderinger i nærings tilgjengelighet og biologiske faktorer som arter til stede i systemet og motilitet av celler spesifikke proteiner tilstede i den ekstracellulære polymere stoff^25,26,27. I enkelte tilfeller biofilm blir plen-lignende (jevn og flat), stund andre vilkår i biofilm vil være grov, LUN eller selv mushroom-lignende²⁸. Mens kvalitativ forskjellen biofilm plener og sopp strukturer kan sees tydelig i mikroskopiske bilder, krever forstå forholdet mellom filmen struktur og biologiske prosesser i filmen systematisk og kvantitativ metoder for å beskrive morfologi. Morfologiske egenskaper foreslått for studie av forskere inkluderer porøsitet, fraktal dimensjon, diffusional lengde, microcolony området på undergrunnen, microcolony kvantum, grovheten koeffisient og tekstur entropi^29,30 .

Bioreaktorer brukes i studiet av biofilm for å etterligne virkelige forhold³¹. Drypp flyt reaktorer (DFR) representerer en lav-skjær miljø der næringsstoffer i media flyter langsomt over celler som er knytte til en overflate over tid å danne en biofilm med et høyt tetthet³². CDC reaktorene er bioreaktorer oppretter en høy skjæring stress flytende miljø ved kontroll av en gripende stang som kontinuerlig roterer i media fylt tank³³. Disse typer bioreaktorer er enkelt å sette opp, men de er begrenset i omfang på grunn av relativt lav utvalgsstørrelsen, høyt inntak av media, store mengder biologisk farlige avfall produsert media drypp renner fra 125 µL/minutt for drypp flyt reaktorer til mer enn 1 mL/min for CDC reaktorer og måtte autoklav store mengder glass og avfall media³⁴. Biofilm vokser ikke jevnt over overflaten på drypp flyt reaktoren fordi lav skjær av media forårsaker etterfølgende langs de større konglomerater P. aeruginosa bakterier derfor biofilm veksten er ikke veldig glatt og ujevn prøvene ikke lett analysert med fluorescens mikroskopi^35,36 .

Noen vanlige bioreactor begrensninger er overvunnet ved hjelp av et medium gjennomstrømming microfluidic bioreactor, der bare ml av media er nødvendig, og reaksjonen platene er liten og lett disponibel etter autoklavering³⁷. Videre, avhengig av antall brønner, mange replikeringer kan utføres i en reaktor kjører, som gir tilstrekkelig mengde data å gjennomføre meningsfull statistisk analyse. I figur 1vises de ulike komponentene av microfluidic-mikroskopi system som tillater kontrollerte forhold, inkludert temperatur og flow rate^38,39,40. Bioreactor er kombinert med fluorescens mikroskopi visualisere fluorescens av EGFP koden i PA01 under brukt lavt gjennom høy skjær forhold som vil etterligne mer realistiske scenarier som er oppstått i miljøet eller i feltet biomedisinsk.

Figur 1 : Individuelle komponenter av Microfluidic. De enkelte komponentene vises fra venstre til høyre: 1. CCD kamera, 2. høy oppløsning invertert mikroskop med automatisert scenen, automatisert fluorescens modul og autofokus modulen, 3. Plate stadium 4: tenkelig system grensesnitt, 5: manuell mikroskop scenen Kontroll, 6: Damp felle, 7: tenkelig system Controller (inkludert temperatur kontroller), 8: Hardware-kontrollere, 9: fluorescens kontrolleren, 10: avbruddsfri strømforsyning, 11: ekstern harddisk for bildelagring, 12: PC-arbeidsstasjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Et utdrag av microfluidic plate er vist i figur 2. Den mest brukte plater består av 48 brønner. Et eksperiment krever en vik og en stikkontakt brønner, totalt 2. Dette gir 24 samtidige eksperimenter som kan utføres med ulike eksperimentelle forhold, som bakteriell stammer, antimikrobielle og media varierte fra kanalen til kanal og kontrollert skjær flyt for hver kolonne med seks kanalene. Eksperimentell temperaturen kontrolleres også med en temperaturinnstilling hele platen. Microfluidic kanaler viser at hver kanal har en serpentin region tilstrekkelig mottrykk og kontrollert skjær.

Figur 2: visualisering av microfluidic kanaler og visningsvinduet. To innløp og utløp brønner med microfluidic kanalene koble dem er markert med røde og grønne fargestoffer. Fargestoff gjør synlig en serpentin region i hver kanal som oppretter tilstrekkelig mottrykk og kontrollert skjær under væskestrøm. Hver visning kanal (i den røde sirkelen) kan avbildes med ønsket bølgelengder. Vises lysende felt (øverst) og lysrør (nederst) mikroskopi bilder av én kanal med en PA01-EGFP biofilm ved hjelp av en 20 X-målet. Skala bar = 80 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

En steg for steg guide gis til brukerne av microfluidic bioreaktorer som er kombinert med fluorescens mikroskopi å utføre romanen biofilm eksperimenter med ulike skjær miljøer. Denne metoden vil tillate utvidelse forsøk med andre mikroorganismer foruten bakterier, som sopp og alger, som har medisinsk og miljømessige programmer^41,42,43. Den detaljerte fremgangsmåten beskriver hvordan du kultur PA01-EGFP, vaksinere en 48-vel plate og sette opp microfluidic enhet og programvare, definere fluorescerende mikroskopet og demonstrere programvare analyse for å få biofilm dekning, vekst, og morfologiske egenskaper som overflateruhet.

Protocol

1. Media forberedelse Forberede minimal media (MM) med 0,25% glukose. For å gjøre 1 L mm med 0,25% glukose, legge 200 mL steril M9 salt løsning, 2 mL steril 1 M MgSO4, 100 µL av sterile 1 M CaCl2og 12,5 mL steril 20% (w/v) glukose vann (dH2O) i et endelig antall 1 L. Overføre nødvendige medier til en steril flaske med sterilt teknikker. Klargjør hvor nødvendig avhengig av antall kanaler som brukes. Hver kanal krever vanligvis 200 µL for grunning, 300 µL for seeding og 1300 µL for 24 h eksperimentet. Plass flasken i en inkubator eller vann bad satt på eksperimentell temperaturen. Media bør være eksperiment temperaturen før bruk for å unngå bobler forming i microchannels. 2. forberedelse av en overnatting og eksperimentelle kultur av PA01-EGFP. Plasser 15 mL av eksperimentelle medier i et sterilt sidearm kolbe og vaksinere med ett eller to kolonier fra en agar plate smykket med PA01-EGFP. Utvid kultur for 12-16 h på en inkubator/shaker bord på 37 ° C og 180-220 rpm. Måle OD600 av natten kultur. OD600 er større enn 0,80, fortynne overnatting kulturen til siste OD av 0,8 med friske MM. sted eksperimentelle kulturen i en inkubator eller vannbad på 37 ° C til nødvendig for såing microfluidic kanalene. Sjekk OD600 igjen umiddelbart før såing for å sikre at det ikke har endret seg vesentlig fra målet OD600, 0,8 i dette tilfellet. 3. utstyr oppstart Sette opp systemet stasjonen i henhold til brukerhåndboken, ligner på oppsettet i figur 1. For å unngå feil i tilkobling av instrumentet til programvaren, slår du på apparatet i følgende rekkefølge:PC-arbeidsstasjonerFluorescens modul. Kontroller at fluorescens lukkeren er på (blå lys av utløserknappen på)Hardware-kontrollereTenkelig system Controller (se Tabell for materiale)CCD kameraImaging stasjon (mikroskopet)Merk: Temperaturen på oppvarmet platen bør justeres til ønsket eksperimentelle temperatur. Start programmet kontroll og angi plate på etiketten på siden av platen.Merk: Etter kontrollprogram starter det vil være to separate programvinduer, for programvaren som styrer mikroskop tenkelig programvare og for kontrollmodulen som styrer pumpen og godt-plate grensesnittet. Dette vises i Figur S1, der “Multi-dimensjonale erverv” menyen er åpen på toppen og kontrollmodulen er satt for en bilen på bunnen. 4. grunning og Seeding Microfluidic platen Merk: Grunning, såing, bakteriell vedlegg og vekst er illustrert i Figur 3. Fjern 48-vel microfluidic platen fra emballasjen og pass på å ikke røre glassoverflaten nederst på platen. Rengjør av objektglass på bunnen av platen med en linseklut, en lo-fri klut eller et lite tørke. For å prime microfluidic kanalene, Pipetter 200 µL av 37 ° C MM i utdataene Vel, å være forsiktig for å unngå bobler. Plasser platen i plate scenen og tørk grensesnittet med etanol, la tørke, før forsegle det på plate scenen. I Manuell modus på kontrollmodulen, angi væske som LB på 37 ° C og Max skjær på 5,00 Dyn/cm2. Klikk utgang brønnene å aktivere flyt fra utdataene til inngangen Vel, grunning kanalene. Etter 5 min grunning, pause flyten å forberede seeding. Nøye fjerne platen fra scenen og Pipetter gjenværende media fra utdataene men ikke fjerner noen av media fra den indre sirkelen som fører til microfluidic kanalene. For å frø eksperimentelle kanalene, først Pipetter 300 µL mm til inngang godt etterfulgt av pipettering 300 µL av bakteriell kultur i utdataene godt inn utdataene godt. Plass platen tilbake i plate scenen og pass på å tørke grensesnittet før du plasserer den på tallerkenen. På kontrollmodulen, fokus på én kanal bruker live kameraet feed etter plassering plate scenen på mikroskopet scenen. Mens visuelt overvåking av live feed, gjenoppta flyt på 1.00 2.00 Dyn/cm2 for ca 2-4 s slik at cellene å åpne eksperimentelle, men ikke i serpentin kanaler. La platen på temperaturstyrt scenen 1t å tillate celle vedlegg. Under 1t incubation, kan den modulen og montasje programvaren settes opp for autorun (trinn 5).Merk: Tiden som er nødvendig for såing vil variere med media og organisme, så det bør overvåkes nøye etter live feed til optimalisert og brukes som en generell tidsramme. Såing hele platen kan variere som ville kreve mer tid brukt flyt i en bestemt kolonne i kanaler for komplett seeding. Etter vedlegg periode, forsiktig fjerne platen fra scenen og Pipetter bakterier fra utdataene først unngå forstyrre kanalen. Med nye pipette tips, fjerne media fra input brønnene. Figur 3 : Eksperimentell oversikt over grunning, såing og vedlegg av PA01-EGFP i microfluidic kanaler. Det grunning, såing, og vedlegg er skissert. Det første trinnet i grunning krever friske medier introdusert til utgangen. Seeding innebærer like mengder media og bakteriell kultur i input og output brønner, henholdsvis. Kulturen bør ikke passere visning segmentet av eksperimentelle kanalen (rød linje) å unngå tilstopping serpentin kanalene. Etter inkubasjonstiden er over, flyter frisk media kontinuerlig fra innspill, vise kammeret og i stikkontakten. Dette starter tilknytning og vekst av bakteriell biofilm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 5. sette programvaren Åpne “Flere dimensjonale oppkjøpet” for å kontrollere mikroskop-bilde oppkjøpet i programvaren. Under “Main”-menyen velger du “Timelapse”, “Flere scenen stillinger” og “Flere bølgelengder” (Figur S1A). Sette opp Lagre innstillingene, opprette et enkelt Basisnavnet, sørge for at det er merket av for intervall Basisnavnet hvis filen finnes . Klikk Velg mappe for å velge mappen som alle filene blir lagret. Inkluder viktige detaljer om eksperimentet i beskrivelsen. Juster varigheten av eksperimentelle tiden til 24 h kategorien Timelapse . For å kontrollere hvor ofte bilder er ervervet, angi Tidsintervallet så bilder er ervervet hver 5 min hele eksperimentet. Tid poengsum justerer automatisk med angitte parametere. Angi stadiet stillinger bruker live kameraet feed i lyse feltet mikroskopet, slik at riktig plassering og fokus. Starter med 10 X målsettingen, fokus på midten av kanalen, ligger over eller under kanalnumrene gravert på tallerkenen. Bytt til 20 X målsettingen, finne optimale visningsområdet og fokalplanet innenfor kanalen. Legge til plasseringen i listen eller erstatte forhåndsinnstilt kanal plasseringen med de nye innstillingene. Angi antall bølgelengder til 3 på bølgelengder -menyen. Bølgelengde 1 (W1), Velg FITC 100% CAM med en 10 ms eksponeringstid. For bølgelengde 2 (W2), velger Brightfield 50% CAM 50% VIS med minimal eksponeringstiden 3 ms. For bølgelengde 3 (W3), som Alle lukket filteret så ingen lys forblir på sist kanal mellom oppkjøpet. Når kontrollmodulen, kontrollerer du at manuell kjøre er stoppet. Angi en ny protokoll for 24 h varighet tid, flyter i retning forover hastigheten ønsket skjær i Redigere Autokjør -menyen under kategorien Konfigurere protokollen . Skjær rate er variert for å studere effekten av biofilm vekst med skjær rate. Klikk Legg til og Lagre som protokoll. Opprett en ny rekkefølge ved å velge LB@37degrees som standard væske for alle kanaler under Rekkefølge oppsett -kommandoen. Velg protokollen med ønsket skjær rate og aktiverer alle kanaler under Trinn gjentakelse 1, for kanaler 1-12. Velg protokollen med annenrangs ønsket skjær og aktiverer alle kanaler for kanaler 13-24. Velg Bruk og Lagre som sekvensen. I Autokjør -menyen velger du lagret rekkefølgen skal brukes for autorun. 6. tidsbestemt Biofilm vekst eksperimentoppsettet Pipetter maksimalt 1 300 µL sterilt mm i input godt av microfluidic platen. Plasser platen tilbake på plate scenen og tørk grensesnittet med etanol, slik at etanol tørke helt, før forsegle platen. Plassere platen scenen på mikroskopet scenen, og være sikker på at protocol(s) og sequence(s) er riktig konfigurert. Velg Start å starte bilen raskt etterfulgt av å klikke Hent for å starte i mikroskopet bildesamlingen. Justere fokus og plassering av alle scenen stillinger mellom bilde oppnåelser. Velg Pause , og bruk av levende bildemodus i lyse feltet bølgelengde, velg Gå til å vise hver scene posisjoner. Angi nye innstillinger ved å velge Angi. Klikk Fortsett før neste planlagte oppkjøpet. 7. se gjennom og analysere bildesekvenser etter tidsbestemt Biofilm vekst eksperimentet For å vurdere hver kanal etter 24 h autorun, i programvaren åpne Gjennom flerdimensjonale Data, ligger under Analyseverktøy. Klikk på velge Base arkiv | Velg katalog å navigere til mappen med bildesekvenser for eksperimentet av interesse. I listen over datasett i mappen som vises, velger du Basisnavnet data rundt. Når dataene rundt er valgt, klikk Vis for å se gjennom disse dataene. Velg en bølgelengde å gjennomgå dataene under bølgelengde -vinduet (Figur S2). Gjennomgang bildet sekvensen for hver kanal velge kanalnummeret under Scenen posisjon og bruker video-kontroller til å analysere dataene for den 289 poeng (forutsatt at bildene er oppnådd hver 5 min over en 24-timers tidsramme). Legg merke til brukbar vekst data.Merk: I hver enkelt kanal, se for utvikling av luftbobler og tresko som vil forstyrre biofilm veksten i kanalen, påvirke dataene. Men hvis dette skjer senere i, sporingsinformasjon før disse omstendigheter kan finnes nyttig. Etter gjennomgang og velge ønskede data for analyse, kan du opprette stabler av bilder for hver kanal. Under fil -menyen velger du Åpne spesielle | Bygge stabel | Nummerert navn. I vinduet Bygge stabel , klikk Velg første bilde og velg det første bildet for stakken i arkiv-mappen. Velg knappen Velg siste bilde og velg filen samsvarer med siste bilde i stakken. Klikk på OK for å åpne stabelen med alle bildene av kanalen i kronologisk rekkefølge. Stabler kan lagres under fil -menyen, Lagre som som tiff-filer.Merk: Ikke Opprett stabler med tommel bilder. Disse filene er ikke veldig nyttig og kan slettes for å spare plass på harddisken. Også lagres bildefiler som følgende:BASE NAME_WAVELENGTH_sCHANNEL #_tIMAGE #.07062018_W1FITC 100_s12_t112 er for eksempel for kanal 12, punkt 112, bildet i første bølgelengde-FITC 100% Kameradata med samme basisnavn “07062018”. Til slutt, velg Lagre som fra fil -rullegardinsmenyen lagre rekkefølgen som en tiff-stabel. Stabler kan også kledde og lagres som en film. Dette er adressert i trinn 9. Før kvantifisere den % dekningen, kan du kalibrere bilde avstandene. Klikk på Kalibrer avstanderunder Analyseverktøy. Velg riktig kalibrering måling, og klikk Bruk på alle åpne bilder. Mens stakken er på det første bildet i rekken, klikk på knappen terskel . Bruk Auto terskelen for lys objekter terskelen for fluorescerende signal (FITC bølgelengde) og Auto terskelen for mørke objekter terskelen i lyse-feltet. Justere terskelen til dekning som representerer dekning av bildet. For fluorescerende terskler, utnytte en kanal med ikke-fluorescerende celler å etablere noen bakgrunn signal og sett minimum terskelverdien utelate signal oppdaget i kanaler som inneholder disse ikke-fluorescerende celler å sikre signal målingen gjør ikke overvurdere området fluorescens. Denne kan være forskjellig fra kjøre å kjøre så det er lurt å bruke minst en, om ikke mer, kanalen eller ikke-fluorescerende kontrollene. For lyse feltet terskler, hvis alle celler som ikke omfattes av orange terskelen signaturen, justeres maksimal terskelverdien enten via skyve verktøylinjen eller bruke Terskelen bilde (funnet under Analyseverktøy) slik at alle celler dekket, men enhver bakgrunn er utelukket.Merk: Mens disse terskelverdier ideelt ville bli brukt for alle bilder i en stabel og alle kanaler, terskelverdier som er valgt for ett bilde/kanal kan ikke være passende for andre bilder eller kanaler, derfor brukeren må justere terskel med jevne mellomrom. Derfor er det lurt å alltid registrere maksimum og minimum terskelverdier brukes bør data måtte bli vurdert senere. Klikk Vis regionen statistikkfor å kvantifisere dekning, under Verktøy. Kontroller at Bruk terskelen er merket, Hele bildet er valgt, og kontroller ønskede mål/innstillinger er valgt under Innhentet Data, (terskel området, gjennomsnittlig, standardavvik, min, maks og % terskelverdi området). Klikk på Åpne Logg og kontroller DDE-filen er valgt før du klikker OK. Velg Microsoft Excel , og klikk OK. Regnearkkomponenten vil åpne, klikk Loggdataene til automatisk registrere målinger av bildet blir analysert. Forlater dette regnearket åpen, bruke samme ark til å samle alle bildedata analyse for én enkelt stakk. I stakken, gå til fjerde bildet og terskelen til de optimale innstillingene. Klikk på Loggdataene i skjermbildet Viser regionen statistikk og verdiene er logget inn i regneark. Gjenta dette for analyse av bilder hvert 15 min. 8. andre analyse inkludert morfologi og overflaten dekning mål ved hjelp av Python skript fra Biofilm morfologi Suite Installere en fordeling av Python 3.6 som omfatter vitenskapelig standardmoduler ved å bruke en standard vitenskapelige Python distribusjon som Anaconda, tilgjengelig på https://www.anaconda.com/download. Hente Biofilm morfologi suiten GitHub i en leser ved å navigere til https://github.com/cdwentworth/Biofilm-Morphology-Suite.git, deretter Velg klone eller nedlasting (grønn knapp) og velg Last ned Zip. Unzip filen og flytte koden mappene til en arbeidskatalog. Måle prosent thresholded dekning ved å kopiere bildestakk til mappen “dekning”. Bruke et terminalvindu koblinger og deretter kjøre skriptet med kommandoenPython bfCoverage.py tiffStackName.tiffra kommandolinjegrensesnittet, der tiffStackName.tif er navnet på filen som inneholder tiff stabelen av bilder. Opprettes en tekstfil som inneholder dekning målinger på hvert punkt med navnet tiffStackName.txt og en grafikkfil med et plott av dekning som en funksjon av tid ville være skapt med navnet tiffStackName.png. Bruke den samme fremgangsmåten som er angitt i trinn 8.3 måle andre morfologiske kjennetegn: biofilm akkumulering og råhet koeffisienten tekstur entropi. Bruke skriptet bfAcc.py for oppsamling måling, roughCoef.py script grovheten koeffisienten måling og skriptet TEvsTime.py for tekstur entropi måling. 9. andre programmer – overlegg og filmer Hvis flere bølgelengder, opprette overlegg stabler inkludert disse bølgelengder. Åpne alle stakker rundt og kalibrere avstanden som gjort i trinn 7.6. Under Verktøyvelger du Overlay bilder. Angi kilder som stabler av interesse. Klikk på rainbow sirkel i FITC stakken, og velg grønne fargefilter legges for å markere denne bølgelengde. Bruk bal justere overlegget slik at FITC stabelen er tydelig i bildene. Når alle justeringer er gjort, velg Alle plan for begge stabler og klikk Bruk. Lagre sjabloner på samme måte som stabler som beskrevet i trinn 7.5 eller en film som beskrevet i trinn 9.2. For å lagre stabler eller overlegg som en timelapse film, under MM Standard og stakk, klikker du på Lage film. Velg kilden som stabel eller overlegg som er ønsket. Klikk Lagre og lagre som Microsoft Video 1 med en kvalitet mellom 70-80.

Representative Results

Figur 4 en viser prosent thresholded området over tid fra en 24 h kjøre skjær strømmer av 0,2 0,5 og 1.0 Dyn/cm2. Biofilm dekning eller prosent terskelen areal (C [%]) var forskjellig for alle tre skjær innstillinger. Biofilm dekningen var raskest på 1,0 Dyn/cm2 skjær, hvor terskelen området økt fra 2-5% til 100% etter 200 min vekst og nådd en stillestående fase etter 400 min. På 0,5 Dyn/cm2, biofilm dekningen var forsinket og begynte å øke på 400 min nå 100% dekning etter 800 min. Laveste skjær på 0,2 Dyn/cm2 tydelig demonstrert tregeste økningen i biofilm dekning, hvor prosent dekning begynte å øke på 500 min, men nådde aldri utenfor området 65% terskel. Disse resultatene indikerte skjær hadde en direkte påvirkning i biofilm dekning. Høyere skjær syntes å være en mer optimal tilstand for biofilm vekst, muligens på grunn av at media gitt bakterier med mer næringsstoffer slik at biofilm kan spre seg raskere. Figur 4: prosent terskelen området, totalt biofilm akkumulering, grovheten koeffisienten, og tekstur entropi. a) prosent terskelen-området (C [%]) over tid bruker 0,2 0,5 og 1.0 Dyn/cm2 over en 24-timers periode. Dataene er Hentet fra en kanal for hver skjær tilstand. b) total biofilm opphopning (relative mål) som en funksjon av tid med 0,2 0,5 og 1.0 Dyn/cm2 over en 24-timers periode. Den svarte linjen er minste kvadrater passer i en eksponentiell modell. Dataene er Hentet fra en kanal for hver skjær tilstand. c) grovheten koeffisient av PA01-EGFP med skjæring stress verdiene av 0,2 0,5 og 1.0 Dyn/cm2 overvåket over 24 h. Data ble Hentet fra en kanal for hver skjær tilstand. d) tekstur entropien i PA01-EGFP bruke skjæring stress 0,2 0,5 og 1.0 Dyn/cm2. Dataene er Hentet fra en kanal for hver skjær betingelse (Valquier-Flynn H., Sutlief, Al, Wentworth, CD, 2018). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 4 b er i samsvar med funnene vises i Figur 4en. Biofilm akkumulering (N[rel]) ble målt basert på antagelsen at GFP signalet på et punkt i et bilde er proporsjonal med levende celle tettheten for denne plasseringen. Det viser at totale relative måling biofilm akkumulering økt som en funksjon av tid med 0,2 0,5 og 1.0 Dyn/cm2 over en 24-timers periode, og veksten redusert fra høyeste skjæring stress til laveste skjæring stress. Det er en klar tidsperiode gir eksponentiell vekst som en kvantitativ vekst kan beregnes. Figur 4 c viser grovheten koeffisient (Ren) på skjær strømmer av 0,2 0,5 og 1.0 Dyn/cm2. Overflateruhet, kvantifisert ved grovheten koeffisient, måle variansen i tykkelse profilen til filmen. Den formelle definisjonen er der Tjeg er jeg-th tykkelse måling, Ten er den gjennomsnittlige tykkelsen, og N er antallet tykkelse måler30. Fremgangsmåten som er beskrevet i denne undersøkelsen måler tykkelsen forbundet med levende celler. En flat ordning av celler vil gi en grovhet koeffisient null mens betydelige variasjoner av tykkelse fra gjennomsnittet vil gi en grovhet koeffisient større enn én. Ligner skjær påvirker vekstraten og prosent terskelen dekningen av filmen, biofilm utstilt forskjellige topografi over tid. Samlet Ren redusert over tid for alle skjær forhold som viser at alle overflater ble jevnere. Men i forhold til laveste skjær av 0,2 Dyn/cm resulterte høyere skjær innstillingene på 0,5 og 1.0 Dyn/cm2 i en glattere overflate over tid som indikerer at en raskere skjær flyt bidratt til jevnere og mer jevnt underlag og høyeste skjær av 1.0 Dyn/cm2 nå under 0,2 Ren. Den glatthet, regularitet eller grov en overflate kan også uttrykkes i tekstur entropi (TE). TE er et brukt i bildeanalyser for å måle graden av tilfeldighet i et todimensjonalt bilde. Beregningen er basert på den grå nivå samtidig forekomst matrisen, definert av Haralick et al., som ser på om bildepunktverdier på ett sted er korrelert med bildepunktverdier på en annen plassering44. En høy grad av sammenheng vil føre til lav entropi. Figur 4 d viser TE på skjær strømmer av 0,2 0,5 og 1.0 Dyn/cm2. TE økt tid for alle skjær forhold, men det høyeste skjæring stresset på 1,0 Dyn/cm nådd maksimal TE (1.0) tidligere enn lavere skjær påkjenninger på 900 min. Laveste skjær av 0,2 Dyn/cm2 hadde den laveste TE (0,8) nådd sitt maksimum etter 1000 min. Men nådd det mellomliggende skjæring stresset 0,5 Dyn/cm2 sin maksimale TE (1.2) mye senere enn høy eller lav skjæring stress betingelsene. Råhet koeffisient og TE måle ulike funksjoner. Mens en flat film ville ha en lav grovheten koeffisient og lav entropi, en film med betydelig variasjon i tykkelse ville ha en høy grovheten koeffisient men kunne fortsatt lav entropi hvis variasjonen er sinusformet i stedet for tilfeldig. I dette tilfellet Ren redusert med økt skjæring stress og tid mens TE trendene ikke er direkte knyttet til skråstille databrikke biofilm formasjon over tid. Figur S1 : Image fange kontroll programvare Vinduer. Vinduet med Multi-dimensjonale oppkjøpet menyen åpne (øverst). Kontrollmodulen satt for en bilen (nederst). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur S2 Bilde av programvaren for gjennomgå dataene. Programvinduet etter velge datasettet rundt ved hjelp av verktøyet Gjennomgang Multi-dimensjonale Data på Verktøy -menyen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Microfluidic systemet og image analysis prosedyren diskutert her fokuserer for microfluidic biofilm eksperimenter for å fastsette morfologiske egenskaper som ikke krever full tredimensjonal informasjonen vanligvis finnes fra AC confocal mikroskopet studier. Disse inkluderte microcolony undergrunnen dekning (prosent dekning), overflateruhet målt grovheten koeffisient og tekstur entropi. En metode for å beregne totalt relative biofilm celle akkumulering er også presentert fase kan beregnes fra hvilke vekstrater i loggen.

Det er flere små men viktige trinn som skal markeres i denne metoden. Tørke grensesnittet med alkohol unngår forurensning av andre bakterier i går fra eksperimentet å eksperiment men også fra brønn til godt i et eksperiment. Grunning og seeding er også svært viktig fordi grunning lar brukeren bestemme hvilke kanaler tillater media å strømme gjennom kanaler uten forstyrrelser eller tilstopping. Kanaler skal ikke forstyrret (dvs. de bør være konstant full av media) etter grunning for å øke sjansene for en vellykket eksperiment med ingen luftbobler eller tilstopping. Seeding trinnet kan varieres ifølge typen bakterier og så skal være optimalisert for cellen vedlegg. For eksempel hvis cellene ikke synes å legge, overflate endringene kan ha på microfluidic platen før såing eller lengre incubations ganger kan være nødvendig. Det er også viktig å sørge for at mikroskopet er korrekt satt opp å få et i fokus bilde og bør overvåkes regelmessig gjennom å forsikre at kvalitet bilder hentes. Hvis fokus er deaktivert, mikroskopet kan og bør justeres som eksperimentet fortsetter. Imens bilde oppkjøpet, bør siste bølgelengden settes til Alle lukket for å unngå eksponering av filtre og belysning til bare én kanal under ventetid som oppstår mellom bilde oppkjøp. Også ble bildeanalyse som bestemmer den % dekningen designet i huset fordi Montage programvare manuell ikke eksplisitt beskrive prosedyren. Videre for å utvide bildeanalyse og fastsette andre egenskaper som overflateruhet, osv., åpen kilde Python-basert kode⁴⁵ ble utviklet i huset og delt på gitHub oppbevaringssted. Det er også begrensninger på hvor mye data kan lagret og administrert på den lokale harddisken, så en ekstern hard kjøre eller deling av data er nødvendig som CyVerse⁴⁶.

Konvensjonelle bioreaktorer, som CDC reaktoren og det dryppe flyt reaktoren³⁴, krever mye media, gir færre utvalgene, og krever en stor mengde sterilisering av utstyr. I kontrast, fordelene ved denne høyere gjennomstrømming plattformen inkludere evnen å kontroll skjær, strømningshastigheter, og antagelsen om at i vitro eksperimenter tett ligner i vivo forhold. Ulemper av systemet inkluderer flere tilbehør og programvare som krever en omhyggelig oppsett som må utføres i riktig rekkefølge av hendelser. Videre manualen som tilbys for utstyret fullt forklarer ikke hvert trinn i eksperimenter, og kommandoene programvare, og dermed mange feil oppstår under forsøkene, inkludert tilstopping av kanaler, mangel på vekst eller vedlegg, eller mangel høykvalitets mikroskopi bilder eller filmer. Selve instrumentet og Forbruksartikler som microfluidic platene, er også relativt dyrt med en prislapp på over $200 per plate og er ikke gjenbrukes. Dermed mens teknikken gir kraftige resultater, den tekniske ekspertisen som kreves for bruken er relativt høy og krever gjentatte opplæring av eksperter på området. Denne rapporten forsøker å løse dette problemet ved å gi en guide til nye brukere av disse bioreaktorer for å studere biofilm egenskaper.

Microfluidic systemet, som er i stand til å utføre mobilnettet analyse, har fått stor oppmerksomhet for ulike vitenskapelige modaliteter, som i mikrobiologi, immunologi, hematologi, onkologi og stamcelleforskning. Mer spesifikt, har teknologien resultert i mange publikasjoner som beskriver emner som er svært relevante for medisinske anvendelser^37,47, inkludert mikrobiell muntlig vedheft⁴⁸, fastsettelse av virkningene av biosurfactants på Pseudomonas aeruginosa og Staphylococcus aureus^49,50, vert patogen interaksjoner i E. coli⁵¹, Streptococcus tilslutning⁵², og behandling på cystisk fibrose⁵³. Gitt det faktum at dette microfluidic systemet er veldig allsidig, er det forventet at flere og flere systemer vil bli distribuert over hele verden.

Noen bestemt protokoll tiltak bør vurderes nøye. Media kan bli fortynnet til 50% med dH₂O for å hindre bobler og tilstopping, men var ikke nødvendig i dette tilfellet. Den bestemte verdien til OD₆₀₀ brukes for seeding må bestemmes ved hjelp av prøveperioden løper av et vekst forsøk for å se hva som fungerer best for bestemt sett med betingelser som brukes. Bobler i brønnene før tetting kan føre til bobler i microfluidic kanaler og bør fjernes ved dukket eller sugd ut med Pipetter tips. Det er viktig å holde bakterier av små serpentin kanalene. Har like volum av medier i inn- og utdataene under seeding prosessen, skal flyt presset flytende volumet kontrolleres så flyt er bare følge av brukt press fra systemet. Kalibrering avstanden bør settes opp under installasjonen av selskapets representant. Disse innstillingene er spesifikke for hvert kamera.

Det finnes flere utfordringer som oppstår når finne mest representative terskelen for et bilde. Angi maksimal terskelverdier kan være vanskelig hvis gjennomsnittlig pixel intensiteten i regioner av bakgrunnen ikke er konsekvent skyldes enten velge en scenen posisjon som ikke er i midten av kanalen eller rusk på tallerkenen. Under MM Standard, falle i staver forarbeide, og velg deretter bakgrunn og skyggelegging korreksjon for korreksjon for disse inkonsekvensene. Dette verktøyet er imidlertid vanligvis bare nyttig hvis brukeren har tatt bilder av kanalene før såing som de kan bruke som referanse bilder. Hvis bakgrunnsskygger referanse bilder er utilgjengelig, brukeren må bruke deres dømmekraft til å angi en terskelverdi som dekker de celle området uten inkludert bakgrunn for hele bildet. Alternativt velge representant områder å måle som ekskluderer regioner inkonsekvens av Klikk Rektangel, Ellipse regioneneller Spor regionen velge en region og velger Aktiv Region i stedet for å hele Bilde i vinduet Vis regionen statistikk (under Analyseverktøy). Hvis en representant region benyttes for terskelverdi lyse feltet bildet, den samme regionen bør brukes for måling av tilsvarende FITC bildet. Det er nyttig å registrere bestemte romlige statistikken (venstre, toppen, bredde, høyde, området, Perimeter) tilknyttet representant regionen så samme region finner og målt på tilsvarende FITC bildet.

For å hindre en oppbygging av data på harddisken som vil føre til tregere, kan en ekstern harddisk kjøpes for datalagring. Et annet alternativ for datalagring og går lettere datadeling er CyVerse bioinformatics plattformen. Opprette en konto på CyVerse systemet ved å gå til http://www.cyverse.org/. Når logget på, starter Discovery miljøet og velg “Logg i CyVerse”. Velg “Data” og gå til du er mappen. Hvis bildestakk er på den lokale datamaskinen Velg “Last opp” og “Enkelt laste opp fra skrivebordet“. Finn stakkfilen bildet og velg for opplasting. Filen eller en mappe deles med samarbeidspartnere hvis de har en CyVerse-konto og gis tillatelse. Deling av data-mappen for allmennheten krever at metadata legges til for hver arkiv benytter CyVerse godkjente standarder. Denne prosedyren vil ikke bli diskutert her fordi dette ikke er innenfor dette arbeidet.

Materials

Ammonium Chloride, ACS	VWR	BDH9208-500G	Part of the minimal media composition
BioFlux 1000 48 Well Low Shear Plate	Fluxion Biosciences	910-0047
BioFlux 1000Z Microfluidic Imaging System	Fluxion Biosciences	BF 1000Z
Calcium Chloride Dihydride, ACD Grade	VWR	97061-904	Part of the minimal media composition
Dextrose, Anhydrous, ACS	VWR	BDH9230-500G	Part of the minimal media composition
Magnesium Sulfate ACS Grade	VWR	EM-MX0070-1	Part of the minimal media composition
Potassium Phosphate Monobasic, ACS Grade	VWR	BDH9268-500G	Part of the minimal media composition
Pseudomonas Aeurginosa GFP	ATCC	15692GFP	Pseudomonas aeurinosa bacterial strain PA01 with GFP modification used for this study.
Sodium Chloride, ACS	VWR	BDH9286-500G	Part of the minimal media composition
Sodium Phosphate, Monobasic, Anhydrous, Reagent Grade	VWR	97061-942	Part of the minimal media composition