体外检测评估神仙体头三个月滋养细胞细胞系的迁移、入侵和增殖
Summary
在这里, 我们提出了一个高度可访问的协议, 用于评估细胞在人类滋养细胞中的运动使用三个体外检测: 划痕试验, 转井入侵试验, 细胞增殖试验。
Abstract
细胞运动是胎盘发育和早孕过程中滋养细胞的重要特性。适当的滋养细胞迁移和入侵的意义表现在妊娠期疾病, 如先兆子痫和宫内生长限制, 这与不充分的滋养细胞入侵的母体血管。不幸的是, 我们对胎盘从迁移滋养细胞中发育的机制的理解是有限的。通过划痕法进行细胞迁移的体外分析是识别调节滋养细胞迁移能力的因素的有用工具。然而, 仅此检测并不能定义可能导致细胞迁移改变的细胞变化。该协议描述了三种不同的体外检测, 这是共同用于评估滋养细胞的运动: 划痕试验, 入侵试验, 和增殖试验。这里描述的协议也可以修改, 用于其他细胞系, 以量化细胞在刺激下的运动。这些方法使调查人员能够确定有助于细胞移动的个别因素, 并对细胞迁移明显变化的潜在机制进行彻底审查。
Introduction
胎盘发育是建立妊娠的关键一步, 影响孕产妇和胎儿的健康。然而, 这一过程发生的机械基础并不完全了解。细胞迁移是一个重要的生物过程, 有助于怀孕期间胎盘的建立和功能。囊胚植入后, 滋养细胞分化为绒毛滋养细胞, 覆盖绒毛膜的表面, 参与气体和营养交换, 以及从绒毛中迁移出来的外生滋养细胞 (evt)并侵入母体和血管 1.evt 的迁移对于重塑产妇螺旋动脉和建立子宫胎盘循环以支持胎儿生长至关重要 2。妊娠期间滋养细胞入侵不足会导致胎盘发育异常, 并可能导致妊娠并发症, 如先兆子宫炎、妊娠期高血压、子宫内生长受限和早产3, 4. 我的工作是什么？因此, 了解影响滋养细胞运动的因素对于确定正常胎盘所需的途径至关重要。
滋养细胞迁移是由一个复杂的信号分子网络控制的, 包括生长因子、细胞因子、激素和血管生成因子5。由于在体内研究胎盘的局限性, 利用永生人类滋养细胞系进行体外检测对于确定导致滋养细胞运动的因素至关重要。划痕和入侵检测已被广泛用于定量评估单个分子在滋养细胞迁移中的作用 6,7, 8.然而, 虽然同时研究细胞入侵的变化可能会导致迁移的变化, 但这两种检测并没有考虑到可能导致细胞迁移率改变的其他机制。例如, 细胞增殖率的降低可能会导致可供迁移的细胞减少。
在这里, 我们描述了使用划痕、细胞增殖和细胞入侵检测来评估滋养细胞迁移的体外定量方法。在划痕试验中, 在细胞单层中创建一个均匀的伤口, 并通过对伤口内细胞的大小和密度进行自动延时成像来测量细胞的迁移以填补缝隙。细胞增殖分析的基础是计算每个时间点的细胞与已知的细胞起始量的比率。在细胞浸润试验中, 细胞被播种在细胞外基质包膜细胞培养插入室 (如 tranwell) 上, 并计算出通过细胞外基质侵入的细胞数量对趋化剂的反应。
划痕检测是一个简单而有效的工具, 可用于确定不同的环境条件如何影响细胞迁移。增殖和入侵检测随后可用于确定细胞增殖和入侵对细胞迁移总体变化的贡献。这些检测方法总体上提供了对生物过程的可靠测量, 这些过程可能有助于细胞的运动。在所述检测中使用了两个不朽的头三个月滋养细胞细胞系: swan.71 (Swan.71) 和 htr-8/svneo9,10。然而, 这些检测也可以优化用于其他细胞类型, 以识别细胞迁移和入侵的关键模块。
Protocol
Representative Results
Discussion
这个程序建立在使用迁移和入侵检测的基础上, 包括细胞增殖率作为一个潜在的贡献者测量的营养细胞运动的差异。一起使用, 这些体外检测是简单而有效的方法, 可用于识别调节滋养细胞迁移的细胞途径。如上所述, 滋养细胞可以用激素、细胞因子、生长因子或其他分子来治疗, 以确定它们对滋养细胞运动的影响。或者, 目标蛋白可能会从细胞中耗尽, 以阐明它们在滋养细胞运动中的功能作用。确?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢 gil mor 博士提供了 sw.71 细胞。这项研究得到了阿尔伯特·麦肯恩·学者奖的支持。
Materials
| 0.4% Trypan blue stain | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| 1.0 M HEPES | AmericanBio | AB06021-00100 | |
| 10 mM MEM non-essential amino acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| 100 mM sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 24-well plate transwell inserts | Corning | 3422 | Contain polycarbonate filters with an 8 μm pore size |
| Charcoal dextran-stripped FBS | Gemini Bio-Products | 100-119 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Fisher Scientific | 8310-4 | |
| Dexamethasone (Dex; 1, 4-pregnadien-9α-fluoro-16α-methyl-11β, 17, 21-triol-3, 20-dione; ≥98% TLC) | Steraloids | P0500-000 | |
| DMEM/Ham’s F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | |
| IncuCyte 24-well ImageLock Plates | Essen BioScience | 4365 | If using the IncuCyte Zoom imaging system, seed cells onto IncuCyte ImageLock Plates. These plates have fiducial markers on the bottom of the plate that are used as a reference for repeat imaging in a constant field of view. |
| IncuCyte software | Essen BioScience | 2010A Rev2 | |
| IncuCyte ZOOM system | Essen BioScience | N/A | Scratch assay images were captured and analyzed using the preset “Scratch Wound” parameters on the IncuCyte ZOOM system. Other time-lapse microscopes may also be used. |
| Matrigel Membrane Matrix | Becton Dickinson | 356231 | Growth factor reduced, phenol-red free |
| Micro Slides | VWR International, LLC | 48311-7003 | |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Penicillin (10,000 units/mL)/streptomycin (10,000 µg/mL) | Life Technologies | 151-40-122 | |
| Phenol-red free DMEM/Ham's F12 | Life Technologies | 11039-021 | |
| Semi-automatic wound maker tool | Essen BioScience | N/A |
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