마이그레이션, 침공, 불멸 하 게 인간의 첫 번째 임신 Trophoblast 셀 라인의 확산을 평가를 생체 외 분석 실험에서

요약

여기, 우리는 3 개의 생체 외 분석 실험을 사용 하 여 인간의 trophoblast 셀에 셀 운동 평가 위한 매우 액세스할 수 있는 프로토콜 제시: 스크래치 분석 결과, transwell 침략 분석 결과 및 세포 확산 분석 실험.

초록

셀 운동은 placental 개발 및 임신 초기 동안 trophoblasts의 중요 한 속성 이다. 적절 한 trophoblast 마이그레이션 및 침략의 중요성 모성 맥 관 구조의 부적당 한 trophoblast 침공과 관련 된 사전 eclampsia 및 자궁내 성장 제한 같은 임신 장애에 의해 증명 됩니다. 불행히도, 메커니즘의 우리의 이해는 태에서 마이그레이션 개발 trophoblasts 제한 됩니다. 스크래치 분석 결과 통해 셀 이동의 생체 외 분석 trophoblast 철새 용량을 조절 하는 요소 식별에 유용한 도구입니다. 그러나, 혼자이 분석 결과 변경 된 셀 이동에서 발생할 수 있는 세포 변화를 정의 하지 않습니다. 이 프로토콜 설명 trophoblast 셀 운동 평가를 공동으로 사용 되는 세 가지 다른 생체 외 분석 실험: 스크래치 분석 결과, 침공 분석 결과 및 확산 분석 결과. 여기에 설명 된 프로토콜 계량 셀 운동 자극에 대 한 응답에서을 다른 셀 라인에 사용 하기 위해 수정할 수 있습니다. 이 메서드는 셀 운동에 기여 하 고 기본 셀 마이그레이션에 명백한 변경 잠재적인 메커니즘의 철저 한 검사를 제공 하는 개별 요소 식별에 조사 수 있습니다.

서론

Placental 발달은 임신, 산 모와 태아 모두 건강에 영향을 미치는의 설립에 중요 한 단계 이다. 그러나, 기계적으로이 프로세스는 발생 합니다 완전히 이해 하지는. 셀 마이그레이션 임신 중의 태 반 기능과 설립에 기여 하는 중요 한 생물 학적 과정 이다. Blastocyst 주입, 다음은 trophectoderm villous trophoblasts 융 villi의 표면을 커버 하 고 가스 및 영양소 교환에 관련 된, 그리고는 villi에서 마이그레이션할 extravillous trophoblasts (EVTs)으로 차별화 그리고 침략 모성 decidua 및 맥 관 구조¹. EVTs의 마이그레이션 모성 나선형 동맥을 개장 하 고 태아 성장²를 지 원하는 uteroplacental 순환 설정에 대 한 필수적입니다. 임신 중 부족 trophoblast 침공 비정상적인 태 반 개발 결과 자간 전 증, 임 신성 고혈압, 자 궁 내 성장 제한, 조산^{3, 등 임신 합병증에 기여할 수 있습니다. 4}. 따라서, trophoblast 운동에 영향을 주는 요소를 이해 정상적인 placentation에 필요한 경로 ....

프로토콜

1. 세포 준비

1. 37 ° C, 5% CO₂, 그리고 95% 습도에서 표준 성장 미디어 T-75 플라스 크에 세포를 유지 합니다.
   참고: 이 실험에 사용 된 세포는 불멸 하 게 했다 처음 임신 trophoblast 셀 라인 Swan.71 (Sw.71) 및 HTR-8/SVneo^9,10. Sw.71 셀 DMEM/F-12와 10% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1.0 m m 나트륨 pyruvate, 10 mM HEPES, 0.10 m m MEM 비필수 아미노산, 100 단위/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스 보충에 유지 되었다. HTR-8/SVneo 셀 RPMI-1640 년 5%로 보충 유지 되었다 열 비활성화 FBS.
2. 90-100%의 합류를 도달할 때까지 복제를 셀 수 있습니다. 메 마른 조직 문화 흐름 후드를 사용 하 여 살 균 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x의 10 mL로 플라스 크 및 세척 세포에서 미디어 발음.
3. PBS를 발음 하 고 1x (0.05%)의 5 mL을 추가 트립 신-EDTA 셀 트립 신에 의해 보호 됩니다 확인 하 고 플라스 크에. 모....

결과

불멸 하 게 인간의 첫 번째 임신 trophoblast 셀 라인 Sw.71 및 HTR-8/SVneo trophoblast 셀 마이그레이션¹²스테로이드 제제의 역할을 결정 하기 위해이 실험에 사용 되었다. 그들은 최근에 보였다 trophoblast 기능 변경 대체 치료 사용된¹²수 있지만 스테로이드 제제가이 실험에 사용 했다. 두 셀 라인 차량 (1 x PBS) 또는 100로 치료 했다 모든 실험에 대 한 합성 glucocorticoid dexamethasone (덱 스)의 nM. 상처 밀도 크기는 자동화 된, 시간 경과 이미징 시스템을 사용 하 여 72 h에 대 한 모든 2 h를 측정 했다. 그림 1 에 이미지와 다른 timepoints에서 스크래치 분석 결과에서 얻은 결과의 예가 나와 있습니다. 두 치료에 대 한 0, 8, 및 18.......

토론

이 절차는 마이그레이션 및 침략의 사용 trophoblast 셀 운동 측정된 차이에 잠재적인 참가자로 셀 확산의 속도 포함 분석 실험 바탕. 함께 사용이 생체 외 분석 실험은 trophoblast 마이그레이션 조절 세포 경로 식별 하기 위해 사용할 수 있는 간단 하 고 효과적인 방법입니다. 위에서 설명한 대로 호르몬, cytokines, 성장 인자, 또는 다른 분자 trophoblast 운동에 미치는 영향을 확인 하려면 trophoblast 세포를 치료할 수 있습니다. 또는 대상 단백질 trophoblast 운동에 그들의 기능적인 역할을 명료 하 게 하는 세포에서 고갈 될 수 있습니다. Trophoblast 마이그레이션 키 변조기를 식별 하는 것은 임신의 기본 합병증 placental 결함, 자간 전 증, 조산, 자궁내 성장 금지 등와 관련 된 기본 메커니즘의 더 나은 이해를 제공할 수 있습니다.

정확한 결과 얻을 하는 데 필요한이 프로토콜에 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.4% 트리판 블루 염색	Thermo Fisher Scientific	15250-061
0.5% 트립신-EDTA	Life Technologies	15400-054
1.0 M HEPES	AmericanBio	AB06021-00100
10 mM MEM 비필수 아미노산	Life Technologies	11140-050
100 mM 피루브산 나트륨	Life Technologies	11360-070
24웰 플레이트 트랜스웰 인서트	Corning	3422	8 &mu의 폴리카보네이트 필터가 포함되어 있습니다. m 기공 크기
숯 덱스트란 박리 FBS	Gemini Bio-Products	100-119
Countess II 자동 세포 계수기	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
크리스탈 바이올렛	시그마 Aldrich	C0775
Cytoseal 60	Thermo Fisher Scientific	8310-4
덱사메타손(Dex; 1, 4-pregnadien-9α-fluoro-16α-methyl-11β, 17, 21-triol-3, 20-dione; ≥ 98% TLC)	스테랄로이드	P0500-000
DMEM/햄' s F12	Life Technologies	11330-032
소 태아 혈청	시그마 Aldrich	F2442
IncuCyte 24웰 ImageLock 플레이트	Essen BioScience	4365	IncuCyte Zoom 이미징 시스템을 사용하는 경우 세포를 IncuCyte ImageLock 플레이트에 시드합니다. 이 플레이트는 플레이트 바닥에 표준 마커가 있어 일정한 시야에서 반복 이미징을 위한 참조로 사용됩니다.
IncuCyte 소프트웨어	Essen BioScience	2010A Rev2
IncuCyte ZOOM 시스템	, Essen BioScience	N/A	스크래치 분석 이미지는 사전 설정 "를 사용하여 캡처 및 분석되었습니다. 긁힌 상처" IncuCyte ZOOM 시스템의 매개변수. 다른 타임 랩스 현미경도 사용할 수 있습니다.
Matrigel Membrane Matrix	Becton Dickinson	356231	성장 인자 감소, 페놀-레드 프리
Micro Slides	VWR International, LLC	48311-7003
현미경 커버 유리	Fisher Scientific	12-545-E
Olympus IX71 도립 현미경	Olympus	IX71
페니실린(10,000 units/mL)/스트렙토마이신(10,000 &마이크로; g/mL)	Life Technologies	151-40-122
페놀-레드 프리 DMEM/Ham's F12	Life Technologies	11039-021
반자동 상처 메이커 도구	Essen BioScience	N/A

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