메르켈 세포 폴리오 감염 및 탐지

Summary

여기, 우리는 프로토콜 기본 인간 피부 섬유 아 세포 MCPyV와 감염을 제시. 프로토콜은 제자리 교 잡에 피부 섬유 아 세포의 분리, MCPyV virions, 바이러스 감염, 면역 형광 염색 법, 형광의 준비를 포함 한다. 이 프로토콜은 MCPyV에 의해 특성화 MCPyV-호스트 상호 작용 및 다른 세포 유형 infectable을 발견에 대 한 확장할 수 있습니다.

Abstract

메르켈 세포 감염 폴리오 (MCPyV)는 메르켈 세포 암 종 (MCC), 매우 공격적인 형태의 피부 암으로 이어질 수 있습니다. 기계 연구 MCPyV 분자 생물학 및 종양 메커니즘을 완벽 하 게 조사를 적절 한 셀 문화 모델의 부족에 의해 방해 되어 있다. 여기, 우리가 수행 하 고 기본 인간 피부 세포의 MCPyV 감염 검출을 위한 프로토콜의 집합을 설명 합니다. 프로토콜 immunofluorescent (IF) 얼룩이와 현장에서 DNA 교 잡 연쇄 반응 (HCR), 매우 민감한은 인간 피부 섬유 아 세포의 고립 재조합 MCPyV virions의 준비 및 바이러스 감염의 탐지 설명 제자리 교 잡 (물고기) 접근에서의 형광 본 프로토콜 관심이 연구원은 다른 세포 유형 또는 MCPyV 감염을 지 원하는 셀 라인을 식별 하 여 적응 될 수 있다. 설명된 물고기 접근 감지 감염 된 인간 피부에 바이러스 성 DNAs의 낮은 수준에 대 한 또한 적응 수 있습니다.

Introduction

메르켈 세포 폴리오 (MCPyV)는 드물지만 적극적인 피부 암, 메르켈 세포 암 (MCC)^1,2와 관련 된 작은, 이중 가닥 DNA 바이러스 이다. 고객 센터, 약 33%의 사망률의 흑색 종^3,4를 초과합니다. MCPyV는^1,~ 5 kb⁵ 일찍 하 고 늦게 지역¹코딩에 비 코딩 규제 지역 (NCRR)에 의해 bisected의 원형 게놈. NCRR 복제 (오 라), 바이러스 성 전사^6,7에 대 한 양방향 발기인의 바이러스 성 기원을 포함 되어 있습니다. 초기 지역 대형 T (LT), 작은 T (sT), 57kT, 대체 LT ORF (알토), 뿐만 아니라 autoregulatory 미르^1,8,,<....

Protocol

인간의 신생아 속하고 펜 피부 질환 연구 센터에서 얻은 했다. 성인 인간 섬유 아 세포는 수술 후 폐기 정상 피부에서 얻은 했다. 모든 프로토콜은 펜실베니아 기관 검토 위원회의 대학에 의해 승인 되었다.

1입니다. 인간 피부 섬유 아 세포의 고립

1. 가 위를 사용 하 여 인간의 신생아 포 피에서 지방과 피하 조직에서 트림 하 고 반쪽 또는 분기 피부 샘플을 잘라.
2. 10 mg/mL dispase PBS 항생제 antimycotic 보충에 II의 5 mL에 조직 품 어 4 ° C에서 하룻밤.
3. 멸 균 10cm 접시에서 신중 하 게 서 집게를 사용 하 여 피부 층에서 표 피를 분리 합니다.
4. 양도 2 mg/mL 콜라의 5 mL를 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브에 결과 피부 조직 FBS 무료 매체 항생제 antimycotic 보충에 4를 입력.
5. 그냥 몇 거시적인 조직 집계 남아 때까지 5% CO₂ 주기적인 동요를 가진 4-6 h 37 ° C에서 샘플을 품 어.
6. Pipetting (분쇄) 위아래로 적극적으로 10 배 10 mL 피 펫과 진 피에서 단일 셀을 분리 하십시오.
7. 5 분, 180 x g 에서....

Results

이 원고에 설명 된 프로토콜 HDFs (그림 1)의 거의 균질 인구의 격리 허용. Immunofluorescent 얼룩에 의해 같이, 거의 100%는 인간의 피부 세포 격리를 사용 하 여이 프로토콜에서 설명 하는 조건을 했다 긍정적으로 스테인드 피부 섬유 마커, vimentin, 및 콜라겐 나²⁴, 그러나 인간에 대 한 부정적인 포 피 keratinocyte 마커 K14 (그림 1). 그림 2 는 ultracentrifuge 농도 후 재조합 MCPyV 게놈 및 virion 샘플을 사용 하 여 MCPyV virions를 생성 하는 과정을 보여준다. 그라데이션 ( 그림 2B화살표에 의해 표시.......

Discussion

인간의 피부 조직에서 피부 섬유 아 세포의 분리, 재조합 MCPyV virions의 준비, 배양된 세포, immunofluorescent 얼룩이 지 고 HCR 기술에서 적응 하는 민감한 물고기 방법의 감염을 포함 하 여, 위에서 설명한 방법입니다 MCPyV 감염²⁷를 분석 하는 연구원을 사용 해야 합니다. 생체 외에서 MCPyV 감염을 달성 하는 가장 중요 한 단계 중 하나는 높은 titer virion 준비의 생산 이다. 여기에 설명 된 재조합 MCPyV virions의 준비에 대 한 프로토콜을 사용 하 여, 우리는 idoxanol 용 매^11,12의 mL 당 10¹² 게놈 사본의 바이러스 titers를 얻을. 이러한 높은 titer MCPyV 준비 우리가 주 피부 세포 유형으로 지금까지 HDFs를 식별 하기 위해 전체 MCPyV 감염을 지원 하기 위해 나타나는<.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
태아 송아지 혈청	HyClone	SH30071.03
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X	Thermo Fisher Scientific	11140050
GLUTAMAX I, 100X	Thermo Fisher Scientific	35050061	L-글루타민
DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음	Thermo Fisher Scientific	14190136
0.05% 트립신-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25300-054
DMEM/F12 매체	Thermo Fisher Scientific	11330-032
재조합 인간 EGF 단백질, CF	R& D systems	236-EG-200	섭씨 -80도에서 보관
CHIR99021	Cayman Chemical	13122	섭씨 -80도에서 보관
CHIR99021	Sigma	SML1046	섭씨 -80도에서 보관
콜라겐 분해 효소 IV 형	Thermo Fisher Scientific	17104019
Dispase II	Roche	4942078001
항생제-항진균제	Thermo Fisher Scientific	15240-062	Protect from light
DMEM medium	Thermo Fisher Scientific	11965084
Alexa Fluor 594 염소 안티-마우스 IgG	Thermo Fisher Scientific	A11032	Protect
from light Alexa Fluor 488 염소 안티-토끼 IgG	Thermo Fisher Scientific	A11034	Protect from light
OptiPrep Density Gradient Medium	시그마	D1556	빛으로부터 보호
파라포름알데히드	시그마	P6148
안티-MCPyV LT (CM2B4)	산타크루즈	sc-136172	Lot # B2717
MCV VP1 토끼		다클론 세럼 #10965	https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm
Hygromycin	Roche	10843555001
Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human Recombinant	Corning	354060	Store at -80 °C
Benzonase Nuclease Sigma		E8263
Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase	EPICENTRE	E3101K
Probe hybridization buffer	Molecular technologies
Probe wash buffer	Molecular technologies
증폭 완충액	분자 기술
Alexa 594 표지 헤어핀	분자 기술	B4	Protect
from light Triton X-100	Sigma	X100
Quant-iT PicoGreen dsDNA 시약	Thermo Fisher Scientific	P7581
BamHI-HF	NEB	R3136
Buffer PB	Qiagen	19066
블루 miniprep 스핀 컬럼	Qiagen	27104
50mL 원추형 원심분리기 튜브	Corning	352070
T4 리가제	NEB	M0202T
MagicMark XP	Thermo Fisher Scientific	LC5602