Arabidopsis थालियाना अंकुर में चीनी समाधान विसर्जन उपचार द्वारा संकुल Stomata के लिए एक प्रेरण प्रणाली
Summary
इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य को प्रदर्शित करने के लिए कैसे एक शर्करा युक्त माध्यम समाधान के साथ विसर्जन उपचार द्वारा Arabidopsis थालियाना अंकुरों के cotyledons में संकुल stomata प्रेरित करने के लिए और कैसे intracellular संरचनाओं का निरीक्षण करने के लिए इस तरह chloroplasts और फोकल लेजर माइक्रोस्कोपी का उपयोग संकुल गार्ड कोशिकाओं में microtubules.
Abstract
Stomatal आंदोलन मध्यस्थता संयंत्र गैस विनिमय, जो प्रकाश संश्लेषण और transpiration के लिए आवश्यक है. Stomatal खोलने और बंद एक महत्वपूर्ण वृद्धि द्वारा पूरा कर रहे है और गार्ड सेल मात्रा में कमी, क्रमशः । क्योंकि आयनों और पानी की शटल परिवहन stomatal आंदोलन के दौरान रक्षक कोशिकाओं और बड़ा पड़ोसी एपिडर्मल कोशिकाओं के बीच होता है, संयंत्र stomata के स्थान पर वितरण stomatal आंदोलन के लिए एक इष्टतम वितरण माना जाता है । perturbing के लिए प्रायोगिक प्रणालियों stomata के स्थान पैटर्न रिक्ति पैटर्न के महत्व की जांच करने के लिए उपयोगी होते हैं । कई प्रमुख अंतरिक्ष stomatal वितरण के साथ जुड़े जीन की पहचान की गई है, और संकुल stomata प्रयोगात्मक इन जीन फेरबदल द्वारा प्रेरित किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, संकुल stomata भी आनुवंशिक संशोधन के बिना exogenous उपचार द्वारा प्रेरित किया जा सकता है । इस लेख में, हम एक सुक्रोज-युक्त माध्यम समाधान के साथ विसर्जन उपचार द्वारा Arabidopsis थालियाना अंकुर में संकुल stomata के लिए एक सरल प्रेरण प्रणाली का वर्णन । हमारे विधि आसान है और सीधे ट्रांसजेनिक या उत्परिवर्ती लाइनों के लिए लागू है । बड़ा chloroplasts सुक्रोज-प्रेरित संकुल रक्षक कोशिकाओं के एक सेल जैविक बानगी के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । इसके अलावा, cortical microtubules के एक प्रतिनिधि फोकल माइक्रोस्कोपी छवि संकुल रक्षक कोशिकाओं के intracellular अवलोकन का एक उदाहरण के रूप में दिखाया गया है । cortical microtubules के रेडियल अभिविन्यास नियंत्रण की स्थिति में अंतरिक्ष गार्ड कोशिकाओं में के रूप में संकुल गार्ड कोशिकाओं में बनाए रखा है.
Introduction
संयंत्र stoma प्रकाश संश्लेषण और transpiration के लिए गैस विनिमय के लिए एक आवश्यक अंग है, और stomatal आंदोलन आयन के माध्यम से गार्ड कोशिकाओं में महत्वपूर्ण परिवर्तन द्वारा पूरा किया है, और पानी की रिहाई संचालित । एक खुर्दबीन के नीचे, हम पत्तियों और तनों की सतहों पर stomata के एक स्थान पर वितरण पैटर्न का पालन कर सकते हैं । stomata के इस स्थान पर वितरण stomatal आंदोलन, जो आयन और गार्ड कोशिकाओं और पड़ोसी एपिडर्मल कोशिकाओं1,2के बीच पानी के आदान प्रदान द्वारा विनियमित है मदद करने के लिए माना जाता है । संकुल stomata के लिए प्रायोगिक प्रेरण प्रणालियों stomata के स्थान पर वितरण के महत्व की जांच के लिए उपयोगी होते हैं ।
यह बताया गया है कि stomata के स्थानिक clustering गार्ड सेल भेदभाव3,4 या एक रासायनिक यौगिक5के साथ उपचार के लिए महत्वपूर्ण जीन के आनुवंशिक संशोधन द्वारा प्रेरित किया जा सकता है । हम यह भी बताया कि सुक्रोज, ग्लूकोज सहित शर्करा के साथ पूरक एक मध्यम समाधान के साथ विसर्जन उपचार, और फ्रुक्टोज कारण stomatal clustering में cotyledons Arabidopsis थालियाना अंकुर6. नई कोशिका दीवारों में कम callose meristemoids और एपिडर्मल कोशिकाओं को अलग सुक्रोज-इलाज cotyledon एपिडर्मिस में मनाया गया था, सुझाव है कि सुक्रोज समाधान विसर्जन उपचार नकारात्मक कोशिका दीवार को प्रभावित करता है, जो रिसाव को रोकता है और गार्ड सेल भेदभाव के लिए प्रमुख जीन उत्पादों की अस्थानिक कार्रवाई (उदाहरण के लिए संलेखन कारकों) आसंन एपिडर्मल कोशिकाओं6की ओर । एक ऐसी ही व्यवस्था gsl8/चौर म्यूटेंट7,8पर अध्ययन से सुझाया गया था । सुक्रोज युक्त मध्यम समाधान का उपयोग संकुल stomata के reproducible प्रेरण के लिए हमारी प्रायोगिक प्रणाली काफी आसान और सस्ता है । यह भी ऐसे organelles के रूप में intracellular संरचनाओं की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और संकुल रक्षक कोशिकाओं में cytoskeleton फ्लोरोसेंट मार्करों कि लेबल intracellular9संरचनाओं व्यक्त ट्रांसजेनिक लाइनों के लिए आवेदन किया, 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
हम एक सुक्रोज-युक्त माध्यम समाधान के साथ विसर्जन उपचार द्वारा एक. थालियाना अंकुर में संकुल stomata की प्रेरण के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है । जैसा कि यहां दिखाया गया है, इस विधि बहुत सरल है और कोई विशे?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम अपने काम के अपने तरह के समर्थन के लिए प्रो Seiichiro Hasezawa के लिए आभारी हैं । यह काम विज्ञान के संवर्धन के लिए जापान सोसायटी से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था (JSPS) KAKENHgrant संख्या 17K19380 और 18H05492, बुनियादी विज्ञान अनुसंधान परियोजनाओं अनुदान संख्या १६०१४६ के लिए एक अनुदान के लिए सुमितोमो फाउंडेशन से, और कैंयन फाउंडेशन T.H. करने के लिए यह प्रायोगिक प्रणाली JSPS KAKENHgrant संख्या २६८९१००६ से कश्मीर के एक वित्तीय सहायता के अंतर्गत विकसित की गई थी. हम Edanz समूह (www.edanzediting.com/ac) से रोबी लुईस, एमएससी, धंयवाद पांडुलिपि के एक मसौदे के संपादन के लिए ।
Materials
| 24-well plate | Sumitomo Bakelite | MS-0824R | |
| 488 nm laser | Furukawa Denko | HPU-50101-PFS2 | |
| 488 nm laser | Olympus | Sapphire488-20/O | |
| 510 nm long-pass filter | Olympus | BA510IF | |
| 524 – 546 nm band-pass filter | Semrock | FF01-535/22-25 | |
| 530 nm short-pass filter | Olympus | BA530RIF | |
| 561 nm laser | CVI Melles Griot | 85-YCA-025-040 | |
| 604 – 644 nm band-pass filter | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| Confocal laser scanning head | Yokogawa | CSU10 | |
| Confocal laser scanning head | Olympus | FV300 | |
| Cooled CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image acquisition software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.8.2.0 | |
| Image acquisition software | Olympus | FLUOVIEW v5.0 | |
| Immersion oil | Olympus | Immersion Oil Type-F | ne = 1.518 (23 degrees) |
| Inverted microscope | Olympus | IX-70 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-71 | |
| Murashige and Skoog Plant Salt Mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 392-00591 | Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497. |
| Objective lens | Olympus | UPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35 | NA = 1.35 |
| Objective lens | Olympus | UPlanAPO 40x / 0.85 NA | NA = 0.85 |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
References
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