Un système d’Induction de stomates groupées par traitement de Immersion de Solution de sucre chez les plantules de Arabidopsis thaliana
Summary
Ce protocole vise à démontrer comment induire des stomates en cluster dans les cotylédons des plantules de Arabidopsis thaliana en traitement d’immersion avec une solution moyenne contenant du sucre et observer des structures intracellulaires tels que les chloroplastes et les microtubules dans les cellules stomatiques en cluster à l’aide de confocal laser microscopie.
Abstract
Stomates mouvement intervient dans les échanges gazeux plante, qui est essentiel pour la photosynthèse et la transpiration. Stomates d’ouverture et de fermeture sont réalisées par une augmentation significative et diminuent du volume de cellules de garde, respectivement. Navette de transport des ions et l’eau se produit entre les cellules de garde et de plus grandes cellules épidermiques voisines durant le mouvement stomatique, la distribution espacée des stomates de la plante est considérée comme une distribution optimale de mouvement stomatique. Des systèmes expérimentaux pour perturber le modèle espacé des stomates sont utiles pour examiner l’importance de l’enchaînement d’espacement. Plusieurs gènes clés associées à la distribution de stomates espacée ont été identifiés, et les stomates en cluster peuvent être induites expérimentalement en altérant ces gènes. Alternativement, des stomates en cluster peuvent être également induites par les traitements exogènes sans modification génétique. Dans cet article, nous décrivons un système simple induction pour cluster stomates chez Arabidopsis thaliana plantules par traitement d’immersion avec une solution moyenne contenant du saccharose. Notre méthode est simple et directement applicables aux lignes transgéniques ou mutants. Plus gros chloroplastes sont présentés comme une caractéristique biologique cellulaire des cellules de garde en cluster induite par le saccharose. En outre, une image microscopique confocale représentative des microtubules corticaux est montrée comme un exemple d’observation intracellulaire des cellules de garde en cluster. L’orientation radiale des microtubules corticaux est maintenue dans les cellules de garde en cluster comme des cellules stomatiques espacés dans des conditions de contrôle.
Introduction
La stomie de plante est un organe essentiel pour l’échange de gaz pour la photosynthèse et la transpiration, et déplacement stomatique est réalisé par des changements significatifs dans les cellules de garde par adoption pilotée par l’ion et une sortie d’eau. Au microscope, on peut observer un modèle de distribution espacés de stomates sur les surfaces des feuilles et des tiges. Cette répartition espacée des stomates est considérée pour aider le mouvement stomatique, qui est régi par échange d’ions et l’eau entre les cellules de garde et les voisins des cellules épidermiques1,2. Systèmes d’induction expérimentale de stomates en cluster sont utiles pour étudier l’importance de la distribution espacée de stomates.
Il a été signalé que le regroupement spatial des stomates peut être induit par une modification génétique des gènes principaux pour la différentiation de cellules de garde3,4 ou un traitement avec un composé chimique5. Nous avons également rapporté que traitement d’immersion avec une solution moyenne additionné de sucres y compris le saccharose, glucose, et fructose causé stomatique clustering dans les cotylédons des plantules de Arabidopsis thaliana 6. Réduit de callose dans nouvelles parois séparant les méristémoïdes et les cellules épidermiques a été observée dans l’épiderme de cotylédon imprégnées de saccharose, ce qui suggère que le saccharose solution immersion traitement affecte négativement la paroi cellulaire, ce qui empêche les fuites et action ectopique des produits des gènes clés pour la différenciation des cellules de garde (par exemple les facteurs de transcription) vers adjacentes épidermique cellules6. Un mécanisme similaire a été proposé d’études sur les gsl8/chor des mutants7,8. Notre système expérimental pour l’induction reproductible des stomates en cluster à l’aide de la solution moyenne contenant du saccharose est assez facile et bon marché. Il peut également être utilisé pour étudier les structures intracellulaires comme les organites et le cytosquelette dans les cellules stomatiques cluster lorsqu’il est appliqué à des lignées transgéniques exprimant des marqueurs fluorescents cette étiquette structures intracellulaires9, 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons présenté des protocoles pour l’induction des stomates en cluster dans les semis d’a. thaliana par traitement d’immersion avec une solution moyenne contenant du saccharose. Comme indiqué ici, cette méthode est très simple et ne nécessite aucun compétences spécialisées, mais peut induire efficacement les stomates en cluster. Plus de 45 % des cellules stomatiques sont groupés avec 3 % contenant du saccharose solution moyenne (valeurs moyennes de plus de 20 observations indépendantes)<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants à m. Seiichiro Hasezawa pour son soutien de notre travail. Ce travail a été prise en charge par des subventions de la société japonaise pour la Promotion of Science (JSPS) KAKENHgrant numéros 17K 19380 18 H 05492, de la Fondation Sumitomo une subvention pour des projets de recherche scientifique fondamentale accorder nombre 160146 et la fondation de Canon à T.H. Ce système expérimental a été développé sous un soutien financier à partir du nombre de pages jsp KAKENHgrant 26891006 à K. A. Nous remercions Robbie Lewis, M.Sc., du groupe Edanz (www.edanzediting.com/ac) pour l’édition d’un projet du manuscrit.
Materials
| 24-well plate | Sumitomo Bakelite | MS-0824R | |
| 488 nm laser | Furukawa Denko | HPU-50101-PFS2 | |
| 488 nm laser | Olympus | Sapphire488-20/O | |
| 510 nm long-pass filter | Olympus | BA510IF | |
| 524 – 546 nm band-pass filter | Semrock | FF01-535/22-25 | |
| 530 nm short-pass filter | Olympus | BA530RIF | |
| 561 nm laser | CVI Melles Griot | 85-YCA-025-040 | |
| 604 – 644 nm band-pass filter | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| Confocal laser scanning head | Yokogawa | CSU10 | |
| Confocal laser scanning head | Olympus | FV300 | |
| Cooled CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image acquisition software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.8.2.0 | |
| Image acquisition software | Olympus | FLUOVIEW v5.0 | |
| Immersion oil | Olympus | Immersion Oil Type-F | ne = 1.518 (23 degrees) |
| Inverted microscope | Olympus | IX-70 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-71 | |
| Murashige and Skoog Plant Salt Mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 392-00591 | Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497. |
| Objective lens | Olympus | UPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35 | NA = 1.35 |
| Objective lens | Olympus | UPlanAPO 40x / 0.85 NA | NA = 0.85 |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
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