Analyse af proteinfoldning, Transport og nedbrydning i levende celler af radioaktivt puls Chase
Summary
Her beskriver vi en protokol for en generel pulse-chase metode, der tillader kinetic analyse af folde-, transport- og nedbrydning af proteiner skal følges i levende celler.
Abstract
Radioaktive pulse-chase mærkning er et kraftfuldt værktøj til at studere en konformationel modning, transport til deres funktionelle cellular placering, og nedbrydningen af mål proteiner i levende celler. Ved hjælp af kort (puls) radiolabeling gange (< 30 min) og stramt kontrolleret chase gange, det er muligt at mærke kun en lille brøkdel af det samlede proteinindhold pool og følge dens foldning. Når det kombineres med nonreducing/reducere SDS-polyacrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) og immunoprecipitation med (kropsbygning-specifikke) antistoffer, kan folde processer blive undersøgt i stor detalje. Dette system er blevet brugt til at analysere folde proteiner med en enorm variation i egenskaber som opløselige proteiner, enkelt og multi-pass transmembrane proteiner, stærkt N og O glykosyleret proteiner, og proteiner med og uden omfattende disulfid limning. Puls-chase metoder er grundlaget for kinetiske undersøgelser i en række ekstra funktioner, herunder co og posttranslationelle modifikationer, oligomerisering og polymerisation, hovedsagelig giver mulighed for analyse af et protein fra fødsel til død. Puls-chase undersøgelser på proteinfoldning supplerer med andre biokemiske og biofysiske metoder til at studere proteiner i vitro ved at give øget tidsmæssige opløsning og fysiologiske oplysninger. Metoder som beskrevet i denne hvidbog er let tilpasses studere foldning af næsten enhver protein, der kan udtrykkes i pattedyr eller insekt-celle systemer.
Introduction
Foldning af selv relativt simple proteiner involverer mange forskellige folde enzymer, molekylære chaperoner og kovalente ændringer1. En komplet rekonstituering af disse processer in vitro- er praktisk talt umuligt, da det store antal forskellige involverede komponenter. Det er derfor ønskeligt, at studere proteinfoldning i vivo, i levende celler. Radioaktive pulse-chase teknikker bevise et kraftfuldt værktøj til at studere den syntese, foldning, transport og nedbrydning af proteiner i deres naturlige miljø.
Den metaboliske mærkning af proteiner i løbet af en kort puls med 35S-mærket methionin/cystein, efterfulgt af en jagt i mangel af en radioaktivt mærket, giver mulighed for specifikke tracking af en population af nyligt syntetiserede proteiner i det bredere cellulære miljø. Derefter, target proteiner kan være isolerede via immunoprecipitation og analyseret via SDS-PAGE eller andre teknikker. For mange proteiner, er deres rejse gennem cellen kendetegnet ved ændringer, der er synlige på SDS-PAGE gel. For eksempel, er transport af glykosyleret proteiner fra det endoplasmatiske reticulum (ER) til Golgi kompleks ofte ledsaget af ændringer af N-knyttet glycans eller tilsætning af O-knyttet glycans2,3. Disse ændringer medføre store stigninger i den tilsyneladende molekylemasse, som kan ses af mobilitet ændringer i SDS-PAGE. Modning kan også være præget af proteolytiske splittelser, såsom signal-peptid kavalergang eller fjernelse af pro-peptider, resulterer i ændringer i den tilsyneladende molekylvægt, der let kan følges på SDS-PAGE gel4. Radioaktivitet har betydelige fordele i forhold til sammenlignelige teknikker som cycloheximide jagter, hvor romanen proteinsyntesen er forhindret, som længere behandlinger er giftigt for celler og udelukker ikke et flertal af ældre, steady-state proteiner fra de analyse, som visse proteiner har halveringstider dage. Sammenligning af proteiner under både nonreducing og reducere betingelser giver mulighed for analyse af disulfid obligation dannelse, et vigtigt skridt i foldning af mange sekretoriske proteiner4,5,6, 7.
Her beskriver vi en generel metode til analyse af proteinfoldning og transport i intakt celler, ved hjælp af et radioaktivt pulse-chase tilgang. Mens vi har til formål at give metoden som detaljeret som muligt, protokollen har en næsten ubegrænsede muligheder for tilpasningsevne og vil tillade optimering at studere hver læser specifikke proteiner.
To alternative pulse-chase protokoller, en for vedhængende celler (trin 1.1 protokollens præsenteres her) og en for suspension celler (trin 1.2 i protokollen præsenteres her) er forudsat. Betingelserne her er tilstrækkeligt til at visualisere en protein udtrykt med medium til høj udtryk niveauer. Hvis læseren arbejder med dårligt udtrykte proteiner eller forskellige posttreatment forhold, som flere immunoprecipitations, er det nødvendigt at øge parabol størrelse eller celle nummer korrekt.
For suspension puls chase, er chase prøver på hvert tidspunkt alle taget fra et enkelt rør af celler. Vask trin efter pulsen er udeladt; i stedet, yderligere indarbejdelse af 35S er forhindret ved fortynding med en høj overskud af umærket methionin og cystein.
De præsenterede protokoller bruger radioaktive 35S-mærket cystein og methionin for at følge cellulære proteinfoldning processer. Alle operationer med radioaktivt reagenser skal udføres ved hjælp af passende beskyttelsesforanstaltninger for at minimere eksponering af operatøren og miljø for radioaktiv stråling og udføres i et laboratorium, der er udpeget. Som puls-chase mærkning teknik er relativt ineffektive på kort puls gange (< 15 min), mindre end 1% af grundbeløbet for radioaktivitet er indarbejdet i de nyligt syntetiserede proteiner. Efter tilsætning af target protein via immunoprecipitation indeholder prøven for SDS-PAGE mindre end 0,05% af grundbeløbet for radioaktivitet.
Selvom 35S methionin og cystein mærkning mix er stabiliseret, vil nogle nedbrydning, fremstilling af flygtige radioaktive stoffer, opstå. For at beskytte forskeren og apparatet, bør der tages nogle forholdsregler. Forskeren bør altid adlyde de lokale stråling sikkerhedsregler og kan bære en trækul sygepleje maske, udover en lab coat og (dobbelt) handsker. Stock hætteglas med 35S methionin og cystein bør altid åbnes i et stinkskab eller under en lokal aspiration punkt. Kendt laboratorium forurening steder er centrifuger, pipetter, vandbade, væksthuse og shakers. Forureningen af disse områder er reduceret ved hjælp af pipette tips med en trækul filter, positive-seal microcentrifuge rør (Se Tabel af materialer), akvarium charcoal svampe i vand bade, trækul papirfiltre limet i puls-chase retter, trækul vagt i aspiration systemet, og placeringen af skåle, som indeholder trækul korn i væksthuse og opbevaringsbeholdere.
Protocol
Representative Results
Discussion
Puls-chase metoder har været af afgørende betydning for udviklingen af forskernes forståelse af proteinfoldning i intakt celler. Mens vi har forsøgt at tilvejebringe en metode, der er så generel som muligt, har denne tilgang potentialet for næsten ubegrænsede variationer at studere forskellige processer, der opstår under folde, transport og liv af proteiner inde i cellen.
Når du udfører en puls chase med vedhængende celler i retter, er det vigtigt at behandle hvert fad, det samme s?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takke alle medlemmerne af Braakman lab, forbi og præsentere, for deres udbytterige drøftelser og hjælpe med at udvikle de metoder, der er præsenteret i denne artikel. Dette projekt har modtaget støtte fra både det Europæiske Forskningsråd under EUs syvende rammeprogram (FP7/2007-2013) N ° 235649 og Holland organisation for videnskabelig forskning (NWO) under ECHO-programmet N ° 711.012.008.
Materials
| 1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.706.400 | |
| Acetic Acid | Sigma | A6283 | glacial acetic acid |
| BAS Storage phosphor screen 20×25 cm | GE Life Sciences | 28956475 | |
| Bromophenol Blue | Sigma | B8026 | Molecular biology grade |
| Carestream Biomax MR films | Kodak | Z350370-50EA | |
| Cell-culture media | Various | N/A | Normal cell culture media for specific cell-lines used |
| Cell-culture media, no methionine/cysteine | Various | N/A | Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine |
| Charcoal filter paper | Whatman | 1872047 | |
| Charcoal filtered pipette tips | Molecular bioproducts | 5069B | |
| Charcoal vacu-guard | Whatman | 67221001 | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | Sigma | 112,553 | for electrophoresis |
| Cysteine | Sigma | C7352 | Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20 |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | Molecular biology grade |
| EasyTag Express35S Protein Labeling Mix | Perkin Elmer | NEG772014MC | Other size batches of label are available depending on useage |
| EDTA | Sigma | E1644 | Molecular biology grade |
| Gel-drying equipment | Various | N/A | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Molecular biology grade |
| Grade 3 chromatography paper | GE Life Sciences | 3003-917 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 24020117 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | Molecular biology grade, Make 1M stock pH 7.4, store at 4˚C |
| Kimwipes delicate task wipes | VWR | 21905-026 | |
| MES | Sigma | M3671 | Molecular biology grade |
| Methanol | Sigma | MX0490 | |
| Methionine | Sigma | M5308 | Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20 |
| Minigel casting/running equipment | Various | N/A | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Molecular biology grade |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E3876 | Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20 |
| PBS | Sigma | P5368 | Molecular biology grade |
| Protein-A Sepharose fastflow beads | GE health-care | 17-5280-04 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | Molecular biology grade |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Molecular biology grade |
| Trizma base (Tris) | Sigma | T6066 | Molecular biology grade |
| Typhoon IP Biomolecular imager | Amersham | 29187194 | |
| Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath | Nalgene | 5970-0320PK |
References
- Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER. Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).
- Pisoni, G. B., Molinari, M. Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation. Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).
- Lamriben, L., Graham, J. B., Adams, B. M., Hebert, D. N. N-Glycan-based ER Molecular Chaperone and Protein Quality Control System: The Calnexin Binding Cycle. Traffic. 17 (4), 308-326 (2016).
- Snapp, E. L., et al. Structure and topology around the cleavage site regulate post-translational cleavage of the HIV-1 gp160 signal peptide. Elife. 6, 26067 (2017).
- Braakman, I., Hoover-Litty, H., Wagner, K. R., Helenius, A. Folding of influenza hemagglutinin in the endoplasmic reticulum. Journal of Cell Biology. 114 (3), 401-411 (1991).
- Jansens, A., van Duijn, E., Braakman, I. Coordinated nonvectorial folding in a newly synthesized multidomain protein. Science. 298 (5602), 2401-2403 (2002).
- Land, A., Braakman, I. Folding of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein in the endoplasmic reticulum. Biochimie. 83 (8), 783-790 (2001).
- Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function. Journal of Visualized Experiments. (117), e54698 (2016).
- Das, A. T., Land, A., Braakman, I., Klaver, B., Berkhout, B. HIV-1 evolves into a nonsyncytium-inducing virus upon prolonged culture in vitro. Virology. 263 (1), 55-69 (1999).
- Chen, W., Helenius, J., Braakman, I., Helenius, A. Cotranslational folding and calnexin binding during glycoprotein synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (14), 6229-6233 (1995).
- Daniels, R., Kurowski, B., Johnson, A. E., Hebert, D. N. N-linked glycans direct the cotranslational folding pathway of influenza hemagglutinin. Molecular Cell. 11 (1), 79-90 (2003).
- Ferreira, L. R., Norris, K., Smith, T., Hebert, C., Sauk, J. J. Association of Hsp47, Grp78, and Grp94 with procollagen supports the successive or coupled action of molecular chaperones. Journal of Cellular Biochemistry. 56 (4), 518-526 (1994).
- Hoelen, H., et al. The primary folding defect and rescue of DeltaF508 CFTR emerge during translation of the mutant domain. PLoS One. 5 (11), 15458 (2010).
- Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. Folding of CFTR is predominantly cotranslational. Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).
- Hagiwara, M., Ling, J., Koenig, P. A., Ploegh, H. L. Posttranscriptional Regulation of Glycoprotein Quality Control in the Endoplasmic Reticulum Is Controlled by the E2 Ub-Conjugating Enzyme UBC6e. Molecular Cell. 63 (5), 753-767 (2016).
- Copeland, C. S., Doms, R. W., Bolzau, E. M., Webster, R. G., Helenius, A. Assembly of influenza hemagglutinin trimers and its role in intracellular transport. Journal of Cell Biology. 103 (4), 1179-1191 (1986).
