여기, 선물이 CD4를 식별 하는 흐름 cytometric 프로토콜+ 와 CD8+ T 세포, γ T 세포, B 세포, NK 세포와 7 대신만 두 형광을 사용 하 여 인간의 말 초 혈액에 monocytes. 이 방법을 5 추가 마커 대부분 교류 cytometers에 기록할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
면역 세포 특성화는 무 겁 게 차동 식 표면 표식에 따라 모집단을 식별 하기 위해 여러 가지 빛깔 cytometry에 의존 합니다. 클래식 멀티 컬러 패널의 설치에는 최고급 악기, 사용자 지정 레이블이 지정 된 항 체, 및 스펙트럼 중복을 최소화 하기 위해 주의 깊은 연구 디자인 필요 합니다. 우리 주요 면역 인구를 식별 하는 multiparametric 분석 개발 (CD4+ 와 CD8+ T 세포, γ T 세포, B 세포, NK 세포, monocytes) 두 형광을 사용 하 여 7 개의 혈통 마커를 결합 하 여 말 초 혈액에서. 우리의 전략은는 혈통 마커 독특한 조합에 각 세포 인구에 의해 표현 됩니다 끊임없이 관찰을 기반으로 합니다. 항 체의 주의 적정와 함께이 정보를 결합 하 여 대부분 교류 cytometers의 광학 제한 확대 5 추가 마커를 기록 하는 조사 수 있습니다. 머리 비교 시연 주변 혈액에서 면역 세포 인구의 대다수 우리의 방법과 고전적인 "한 형광 색소 1 마커 접근", 사이 대 등 한 정확도로 나타낼 수 있다 비록 후자는 여전히 NKT 세포 등 γ T 세포 인구를 식별 하는 데 더 정확 하다 두 형광을 사용 하 여 7 개의 마커를 결합 하 여 복잡 한 면역 세포 인구와 저렴 한 6-10 형광 색소 교류 cytometers, 그리고 한정 된 자원 가진 지역에서 2-3 형광 색소 필드 악기에도 임상 샘플의 분석에 대 한 수 있습니다. 최고급 악기도 깊은 교류 cytometry 분석을 달성 하기 위해 여분의 형광을 사용 하 여이 접근에서 활용할 수 있습니다. 이 접근은 또한 매우 잘 임상 샘플 셀의 제한 된 수의 경우 여러 세포 인구를 심사 적합 합니다.
서론
Cytometry 이벤트 두 번째1당 몇 천의 속도로 단일 입자에 여러 매개 변수를 분석 하에 개발 된 기술입니다. 표본 cytometry 분석의 예는 포함 되지만 셀, 구슬, 박테리아, 소포 및 염색체에 국한 되지 않습니다. 유체 시스템 어디 하나 이상의 레이저와 그것의 경로 교차 하는 각 입자 및 여러 매개 변수는 추가 분석을 위해 기록 됩니다 심문 지점에서 입자를 지시 합니다. 앞으로 및 측면 살포, 순수한 레이저 빛의 산란에 의해 생성 된 대상 인구를 식별 하 고 각각 상대적인 크기와 입자의 내부 복잡성/단위에 대 한 정보를 검색 하는 데 사용 됩니다. 모든 다른 매개 변수, 흐름 cytometric 분석에서 데이터의 대부분을 담당 하는 형광 색소 표시 된 조사는 인식 하 고 바인딩할 특정 대상의 입자에 의해 파생 됩니다.
Cytometry 면역학 연구 특성화 세포 인구를 식별 하는 기본 도구입니다. 면역 시스템의 복잡성을 해 부하 다 색 패널은 세포 인구1의 깊은 immunophenotyping 동시에 기록 하는 마커의 수를 확장할 끊임없이 진화 된다. 이것은 20 형광 매개 변수를 초과 하는 최근 하이 엔드 흐름 cytometers 형광, 및 더 ....
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프로토콜
인간의 물질의 모든 연구는 건강 보험 이동성 및 책임에 관한 법률에서 존스 홉킨스 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다. 환자 및 제어 샘플 드 확인 했다입니다. PBMCs와 건강 한 컨트롤에서 혈액은 동의 의해 얻은 했다.
참고: 이 프로토콜에 갓 테스트 되거나 고립 된 냉동 주변 혈액 세포와 전체 혈액.
1. 세포 준비
-
전체 혈액에서 주변 혈액 세포 (PBMC)의 절연
- 포함 된 나트륨 덤플링을 10 mL 그린 탑 튜브에 혈액을 그립니다. 피와 튜브를 작성 후 즉시 반전 튜브 여러 번 응고를 방지 하기 위해.
참고: 튜브 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 또는 나트륨 시트르산 등 다른 응고 제를 포함 하는 비교 결과 함께 사용할 수 있습니다. 혈액의 다른 금액을 수집 하는 경우 프로토콜에는 다음 단계 따라 조절 한다. - 신중 하 게 50 mL 원뿔 튜브로 그려진된 혈액 전송. 칼슘과 마그네슘 없이 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)의 동일한 금액으로 혈액을 희석.
- 새로운 50 mL 원뿔 튜브의 하....
- 포함 된 나트륨 덤플링을 10 mL 그린 탑 튜브에 혈액을 그립니다. 피와 튜브를 작성 후 즉시 반전 튜브 여러 번 응고를 방지 하기 위해.
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결과
설정 및 인간 주변 혈액 세포의 흐름 cytometry 실험의 분석 물 7 혈통 마커 (안티-CD3-CD4,-CD8,-CD14,-CD19-CD56, TCR-γ 항 체)만 두를 사용 하 여 형광 표시 됩니다.
한 안티 CD8-CD56 항 체 적정 대표적인 결과 설명 합니다. 각 항 체에 대 한 (이 예제에서는 안티-CD8), 10 연속 2-fold 희석에서 데이터 얼룩 인덱스 곡선 (그림 1A-C)을 계산 하기 위해 기록 되었다. 최적의 항 체 농도 최대 얼룩 인덱스 신호13,14에 의해 결정 되었다. 희석 피크 또는 얼룩 인덱스 곡선의 상승에 피크를 가까이에서 선택 되어야 합니다. 안티-c d 4와-CD56 항 체 (적정 이전) .......
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토론
여기에 제시 된 프로토콜 매우 유연 하 고 변화 버퍼, 온도 및 셀 표면에 혈통 마커의 높은 표현으로 인해 주변 혈액 세포 준비 얼룩에 구분 표시 되었습니다. 높은-품질, 재현할 수 데이터를 얻기 위해 가장 중요 한 단계는 항 체 적정. 주의 때문에 항 체의 적정 흐름 cytometric 패널의 설치 하는 동안 항상 수행 해야이 단계 추가 하지 않습니다 여분 벤치 타임 우리의 2-형광 색소 접근. 안티-CD3의 적정-CD8,-CD14-CD19, TCR-γ는 최적으로 긍정적이 고 부정적인 봉우리를 별도의 항 체의 농도 최대 인덱스13,14얼룩에 의해 파생 된 표준 절차를 따릅니다. 피크 또는 얼룩 인덱스 곡선의 상승에 피크에 가까이에 희석 되어야 합니다 (그림 1A-C)을 선택. 다른 한편으로, 안티-c d 4와 안티 CD56 항 체의 ad h.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
이 연구는 국립 연구소의 관절염과 Musculoskeletal와 피부 질환에 의해 지원 되었다 < https://www.niams.nih.gov/>, 보너스 번호 P30-AR053503; 스 테 블러 재단, www.stablerfoundation.org; 국립 연구소의 알레르기와 전염병, www.niaid.nih.gov, T32AI007247; 니 나 아일랜드 프로그램 폐 건강 (NIPLH)에 대 한 https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| CD3 | BD Biosciences | 562426 | 염색 항체 RRID: AB_11152082 |
| CD56 | BD Biosciences | 562751 | 염색 항체 RRID: AB_2732054 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331217 | 염색 항체 RRID: AB_2562316 |
| CD4 | BD Biosciences | 555347 | 염색 항체 RRID: AB_395752 |
| CD8 | BD Biosciences | 555367 | 염색 항체 RRID: AB_395770 |
| CD14 | BD Biosciences | 555398 | 염색 항체 RRID: AB_395799 |
| CD19 | BD Biosciences | 555413 | 염색을 위한 항체 RRID: AB_395813 |
| CD3 | BD Biosciences | 555335 | 염색을 위한 항체 RRID: AB_398591 |
| CD56 | BD Biosciences | 555518 | 염색을 위한 항체 RRID: AB_398601 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331211 | 염색용 항체 RRID: AB_1089215 |
| CCR7 | Biolegend | 353217 | 염색용 항체 RRID: AB_10913812 |
| CD45RA | BD Biosciences | 560674 | 염색용 항체 RRID: AB_1727497 |
| CCR4 | BD Biosciences | 561034 | 염색용 항체 RRID: AB_10563066 |
| CCR6 | BD Biosciences | 353419 | 염색용 항체 RRID: AB_11124539 |
| CXCR3 | BD Biosciences | 561730 | 염색 RRID에 대한 항체: AB_10894207 |
| CD57 | BD Biosciences | 562488 | 염색에 대한 항체 RRID: AB_2737625 |
| HLA-DR | BD Biosciences | 563083 | 염색 RRID에 대한 항체: AB_2737994 |
| CD16 | BD Biosciences | 563784 | 염색에 대한 항체 RRID: AB_2744293 |
| Dead cells | Life technologies | L-23105 | Live/dead discrimination |
| Falcon 5 mL 라운드 바닥 폴리스티렌 시험관 (세포 여과기 스냅 캡 | 포함) BD Bioscience | 352235 | 유세포 분석기를 통과하기 전에 세포 현탁액을 필터링하는 |
| BD | Bioscience | 352001 | 염색 전 전혈 |
| 회수 세포 배양 동결 매체 | Thermo fisher | 12648010 | 동결 세포 |
| 96웰 V-바닥 플레이트 | Thermo fisher | 249570 | 염색용 플레이트 |
| FACSAria IIu 세포 분류기 | , BD Biosciences, | 유세포 분석기 | |
| FCS Express, 6 | De Novo 소프트웨어 | , FACS 분석 | |
| Graphpad, Prism | GraphPad 소프트웨어 | 데이터 분석 |
참고문헌
- Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. A deep profiler's guide to cytometry. Trends in Immunology. 33 (7), 323-332 (2012).
- Boin, F., et al. Flow cytometric discrimination of seven lineage markers by using two fluorochromes. PLoS ONE. 12<....
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재인쇄 및 허가
