Summary

人类外周血神经细胞分离通过评估Rab10磷酸化来询问帕金森氏症相关的LRRK2激酶途径

Published: March 21, 2020
doi:

Summary

白氨酸丰富的重复激酶2基因(LRRK2)的突变导致遗传性帕金森病。我们开发了一种简单可靠的方法,用于评估人类外周血中Rab10的LRRK2控制磷酸化。这可能有助于识别具有增加LRRK2激酶通路活性的个人。

Abstract

白细胞丰富的重复激酶2(LRRK2)是遗传性帕金森病(PD)中最常见的突变基因,所有致病性LRRK2突变导致其激酶功能过度活化。在这里,我们描述了一种简单而可靠的测定方法,通过测量其生理基质之一Rab10的生理基质之一Rab10,以量化人类外周血神经中粒体中的LRRK2激酶通路活性。所述的免疫印迹分析需要完全选择性和磷特异性抗体,能够识别LRRK2对Rab10 Thr73表皮磷酸酯,如MJFF-pRab10兔单克隆抗体。它使用人类外周血嗜中性粒细胞,因为外周血很容易获得,嗜中性粒细胞是丰富和同质的成分。重要的是,嗜中性粒细胞表示LRRK2和Rab10的较高水平。嗜中性粒细胞的潜在缺点是其高内在丝氨酸蛋白酶活性,这需要使用非常有效的蛋白酶抑制剂,如有机磷神经毒素二氟磷酸二磷酸二磷酸(DIFP)作为淋索缓冲液的一部分。然而,嗜中性粒细胞是研究LRRK2激酶在体内活性的宝贵资源,应考虑纳入PD生物库收集。

Introduction

减缓或阻止帕金森病(PD)的尝试迄今都失败了。在白细胞富重复激酶2(LRRK2)中发现超活化突变,导致和/或增加PD的风险,导致LRRK2激酶抑制剂11,2,32,3的发展。这些已经进入临床试验4。LRRK2的确切功能尚不清楚,但一个重大的进步是确定一个子集的Rab GTPase蛋白,包括Rab10,作为LRRK2激酶55,6,76,7的第一个真正的生理基质。在疾病改变治疗时代的主要挑战是LRRK2激酶激活状态的生化标记物和LRRK2激酶抑制剂的目标参与。

到目前为止,LRRK2抑制剂体内的主要药代动力学标记物是LRRK2的一组磷酸化血清残留物,特别是丝氨酸935,这些残留物因对不同的LRRK2抑制剂88、99而变得脱磷化。然而,丝氨酸935磷酸化与内在细胞LRRK2激酶活性无关,因为它不是LRRK2直接磷酸化,并且仍然磷酸化在激酶不活性LRRK210。LRRK2激酶活性与丝氨酸1292的自磷酸化密切相关,但实际来说,由于目前该站点10、11,11缺乏可靠和磷特异性抗体,因此,通过免疫blot分析整细胞提取物,它不是内源性LRRK2激酶活性的合适读出。

我们开发了一种强健且易于测定的测定方法,用于量化人类外周血细胞中的LRRK2激酶通路活性,测量其生理目标蛋白Rab10在threonine 7311的LRRK2控制磷酸化。外周血很容易通过单月切除,这是一个低风险和快速的程序,导致最小的不适。我们专注于人类外周血嗜中性粒细胞,因为它们构成丰富的(占所有白细胞的37-80%)和同质细胞群,表示相对较高的LRRK2和Rab1011水平。此外,外周血嗜中性粒细胞可以通过采用免疫磁阴性方法快速有效地分离。为了确保随后观察到的Rab10磷酸化由LRRK2介导,每批嗜中性粒细胞都孵育有或没有强效和选择性的LRRK2激酶抑制剂(我们使用并推荐MLi-2)2,12。2,12然后,在含有蛋白酶抑制剂二丙酸酯磷酸(DIFP)的缓冲液中细胞水解,这是抑制内生氨酸蛋白酶活性所必需的,已知在中性粒细胞中含量高13。对于定量免疫印迹的最终分析,我们建议使用MJFF-pRab10兔子单克隆抗体,专门检测Rab10 Thr73-磷脂蛋白,并且不与其他磷酸化的Rab蛋白14发生交叉反应。这种抗体的选择性和特异性已验证在不同的Rab蛋白和A549 Rab10敲出细胞系14的过度表达模型。因此,我们测量了使用和未经过强效和选择性LRRK2激酶抑制剂2治疗的中性粒细胞中Rab10磷酸化的差异。或者,也可以通过其他方法(如定量质谱法)分析样品。

最后,LRRK2控制的Rab10磷酸化是LRRK2激酶活性对935号丝氨酸LRRK2磷酸化的优越标志,人类外周血嗜中性粒细胞是PD研究LRRK2的宝贵资源。我们的协议提供了一个强大和容易的测定,以查询LRRK2途径活性在外周血神经中,并允许生物化学分层的人与增加LRRK2激酶活性15。重要的是,这些个体可能受益于未来的LRRK2激酶抑制剂治疗。

Protocol

根据英国当地法规,人类血液的所有操纵和移液都发生在第 2 类生物安全柜中。所有程序均符合当地道德审查委员会的规定,所有参与者均提供知情同意。 1. 准备 制备 0.1 mL EDTA 库存溶液 1,在磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中含有 100 mM EDTA。 准备 60 mL EDTA 库存解决方案 2,在 PBS 中包含 1 mM EDTA。 准备含 50 mM Tris-HCl 的集石液缓冲液 (pH = 7.5), 1% (v/v) Triton …

Representative Results

我们的测定允许用LRRK2依赖Rab10磷酸化作为读出,在人类外周血中查询PD相关的LRRK2激酶的激活。嗜中性粒细胞是一种同质和丰富的外周白细胞群,表示LRRK2和Rab10蛋白质的高水平(图1)。其余外周血单核细胞(PBMC)中唯一具有高拷贝数的两种蛋白质的细胞是单核细胞,但这些细胞只占白细胞的2-12%。这表明外周血嗜中性粒细胞是研究LRRK2控制的Rab10磷酸化的更合适的生物基质?…

Discussion

令人信服的临床、遗传和生化证据表明LRRK2具有重要作用,尤其是其激酶在帕金森病中的作用7。LRRK2激酶抑制剂已经开发,并进入临床试验22,4,12。4,12因此,需要利用LRRK2作为生物标志物,用于目标参与和患者分层。我们的协议描述了一个强大和容易的测定,用于分析LRRK2激酶途径激活,其生理基质Rab10在人?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我们感谢健康志愿者为本研究献血。我们感谢迈克尔·福克斯帕金森病研究基金会(MJFF)和福克斯生物网研究领导(FBN)对书面协议和视频的支持和投入。我们感谢奥地利维也纳大学的亚历山大·津普里奇教授测试我们的协议和合作。我们重视保罗·戴维斯对项目的贡献(MRC PPU总经理)。我们还认可MRC蛋白磷酸化和泛化单元(PPU)的出色技术支持,即化学合成(纳塔利娅·什皮罗合成MLi-2)、MRC PPU试剂和服务抗体净化团队(协调希拉里·麦克劳赫兰和詹姆斯·哈斯蒂)。我们感谢来自Vivomotion的MhairiTowler和弗雷泽·默多克在制作视频和动画方面的帮助。我们感谢来自81部电影的史蒂夫·索夫协助进行最后的编辑。埃丝特·萨姆勒由苏格兰高级临床学术奖学金资助,并接受了英国帕金森氏症(K-1706)的资助。

Materials

1 mL Pipette tips Sarstedt 70.762 or equivalent
1.5 mL Micro tubes Sarstedt 72.690.001 or equivalent
10 mL Pipette tips  Sarstedt 86.1254.025  or equivalent
10 μL Pipette tips Sarstedt 70.113 or equivalent
15 mL falcon tube  Cellstar 188 271 or equivalent
200 μL Pipette tips Sarstedt 70.760.002 or equivalent
25 mL Pipette tips  Sarstedt 86.1685.001 or equivalent
50 mL falcon tube  Cellstar 227 261 or equivalent
BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube BD  BD 367525 or equivalent
Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge Beckman or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g
Category 2 biological safety cabinet.
cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail Roche 11836170001
DIFP (Diisopropylfluorophosphate)  Sigma D0879 Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions 
Dimethyl sulfoxide  Sigma 6250
Dry ice or liquid nitrogene
Dulbecco's phosphate-buffered saline  ThermoFisher 14190094 or equivalent
Easy 50 EasySep Magnet  Stemcell 18002 for holding 1 x 50ml conical tube
EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit  Stemcell 19666 This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads
EGTA Sigma E3889
Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge Eppendorf
Ethanol, in spray bottle
Ethylenediaminetetraacetic acid  Sigma E6758
Ice
Isopropanol (anhydrous grade)  Sigma 278475
Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP).  alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/)
Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2) Merck 438194-10MG or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor)
Microcystin-LR Enzo Life Sciences ALX-350-012-M001 1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC. 
Na3VO4 Aldrich 450243
NaF Sigma S7920
Odyssey CLx scan Western Blot imaging system Odyssey
Permanent marker pen
Personal protection equipment
RPMI 1640 Medium  ThermoFisher 21875034 or equivalent
sodium pyrophosphate Sigma S22
sucrose Sigma S0389
β-glycerophosphate Sigma 50020
β-mercaptoethanol Sigma M3148
Suggested antibodies for Western blotting
Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21] abcam ab230261
Anti-α-tubulin Cell Signaling Technologies 5174 used at 1:2000 dilution
Goat anti-mouse IRDye 680LT LI-COR 926-68020 used at 1:10,000 dilution
Goat anti-mouse IRDye 800CW LI-COR 926-32210 used at 1:10,000 dilution
Goat anti-rabbit IRDye 800CW LI-COR 926-32211 used at 1:10,000 dilution
MJFF-total Rab10 mouse antibody generated by nanoTools (nanotools.de) not applicable* used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018
Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody Antibodies Incorporated  75-253 used at 1 μg/ml final concentration
pS935-LRRK2 MRC PPU Reagents and Services UDD2 MJFF-total Rab10 mouse antibody

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Cite This Article
Fan, Y., Tonelli, F., Padmanabhan, S., Baptista, M. A., Riley, L., Smith, D., Marras, C., Howden, A., Alessi, D. R., Sammler, E. Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson’s Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation. J. Vis. Exp. (157), e58956, doi:10.3791/58956 (2020).

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