Medindo a forma e o tamanho das partículas de lodo ativado imobilizada em ágar com um Pipeline de Software de código aberto
Summary
O tamanho e forma das partículas em lamas activadas são parâmetros importantes que são medidos através de diferentes métodos. Imprecisões decorrem de amostragem não-representativo, imagens de qualidade inferior e parâmetros de análise subjetiva. Para minimizar esses erros e facilitar a medição, apresentamos um protocolo especificando cada passo, incluindo um pipeline de software de código aberto.
Abstract
Biorreatores experimentais, tais como aqueles tratamento de águas residuais, contêm partículas cujo tamanho e forma são parâmetros importantes. Por exemplo, o tamanho e a forma de flocos de lodo ativado podem indicar as condições para a microescala e também diretamente afetar bem como o lodo se instala um clarificador.
Forma e tamanho de partícula são as duas medições enganadoramente ‘simples’. Muitas questões sutis, muitas vezes sem resposta nos protocolos informais, podem surgir quando a amostragem de imagem e análise de partículas. Métodos de amostragem podem ser tendencioso ou não fornecem energia suficiente estatística. As amostras se podem ser mal conservadas ou sofrem alteração durante a imobilização. As imagens podem não ser de qualidade suficiente; sobreposição de partículas, profundidade de campo, nível de ampliação e vários ruído pode tudo produzir maus resultados. Análise mal especificado pode apresentar viés, como que produzido por limiarização de imagem manual e segmentação.
Acessibilidade e throughput são desejáveis ao lado de reprodutibilidade. Um método acessível, alta taxa de transferência pode permitir mais frequente medição de partículas, produzindo muitas imagens contendo milhares de partículas. Um método que utiliza reagentes de baixo custo, um microscópio comum de dissecação e software de análise de código aberto disponível gratuitamente permite resultados experimentais repetíveis, acessíveis, reprodutíveis e parcialmente automatizada. Além disso, o produto de tal método pode ser bem formatada, bem definidos e facilmente compreendida pelo software de análise de dados, facilitando as análises em laboratório e dados de compartilhamento entre laboratórios.
Apresentamos um protocolo em que detalha os passos necessários para produzir um produto desse tipo, incluindo: amostragem, preparação e imobilização em ágar, aquisição de imagem digital, análise de imagem digital e exemplos de geração de experiência específica figura da amostra a resultados da análise. Nós também incluímos um pipeline de análise de dados de código aberto para suportar este protocolo.
Introduction
A finalidade desse método é fornecer um método bem definido, repetível e parcialmente automatizada para determinar as distribuições de tamanho e forma das partículas em biorreatores, particularmente aqueles que contêm flocos de lodo ativado e grânulos aeróbio1 , 2. a lógica por trás deste método melhorar a acessibilidade, a simplicidade, a taxa de transferência e, repetibilidade dos nossos actuais protocolos in-house3,4, facilitar a medição de partículas para os outros e facilitar a partilha e comparação de dados.
Existem duas grandes categorias de análise de medição de partículas – direto de imagem e inferencial métodos usando tais qualidades como espalhamento de luz5. Embora métodos inferencial podem ser automatizados e têm grande rendimento, o equipamento é caro. Além disso, enquanto métodos inferencial podem determinar com precisão o tamanho equivalente de uma partícula6, eles não fornecem informações de forma detalhada7.
Devido à necessidade de dados da forma, baseamos nosso método de direta de imagens. Embora existam alguns métodos da imagem latente de alta produtividade, solicitaram-se tradicionalmente caro hardware comercial ou soluções personalizadas construídas8,9. Nosso método foi desenvolvido para empregar comum, acessível de hardware e software que, embora sofrendo uma redução na taxa de transferência, produz imagens de partículas muito mais do que o mínimo necessário para muitas análises10.
Protocolos existentes não podem especificar importante amostragem e etapas de aquisição de imagem. Outros protocolos podem especificar etapas manuais que introduzir viés subjetivo (como ad-hoc limiarização11). Um método bem definido que especifica a amostragem, imobilização e imagem etapas de aquisição, combinadas com o software de análise livremente disponível irá melhorar tanto a análise de imagem dentro de laboratório e comparações entre laboratórios. Dos principais objetivos do presente protocolo é fornecer um fluxo de trabalho e ferramentas que devem conduzir a resultados reprodutíveis de laboratórios diferentes para a mesma amostra.
Além de normalizar o processo de análise de imagem, os dados produzidos por este gasoduto são gravados em um arquivo bem definidas e bem formatada12 adequado para uso por populares dados análise pacotes13,14, facilitando a experiência análises específicas (tais como geração de figura personalizada) e dados facilitando compartilhamento entre laboratórios.
Este protocolo é especialmente sugerido para pesquisadores que necessitam de dados de forma de partícula, não têm acesso aos métodos inferencial, não pretendo desenvolver seu próprio pipeline de análise de imagem e gostaria de compartilhar seus dados facilmente com outros
Protocol
Representative Results
Discussion
Embora o sistema de análise de imagem é bastante robusto e QC medidas para assegurar imagens pobres são removidas, devida atenção a questões específicas na amostragem, preparação de chapa e aquisição de imagens pode melhorar tanto a precisão dos dados e a proporção de imagens passando QC.
Concentração de amostragem
Supondo que tomou-se uma amostra representativa, o passo mais importante é assegurar a partículas suficientes para análise eficiente e represe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por um subsídio da National Science Foundation CBET 1336544.
Os logotipos de FIJI, R e Python são usados com a em conformidade com as seguintes diretivas de marca:
Python: https://www.python.org/psf/trademarks/
R: https://www.r-project.org/Logo/ , conforme a licença CC-BY-SA 4.0 listada em: https://creativecommons.org/Licenses/by-sa/4.0/
Fiji: https://imagej.net/Licensing
Materials
| 10% Bleach solution | Chlorox | 31009 | For workspace disinfection. |
| 15 mL centrifuge tube with cap | Corning | 430790 | Per sample. |
| 50 mL Erlenmeyer flask | Corning | 4980-50 | Other vessels are suitable so long as they can contain > 40 mL of sample and allow mixing |
| 500 mL Kimax Bottle | Kimble-Chase | 14395-50 | Or otherwise sufficient for agar handling |
| Agar | BD | 214010 | Solid, to prepare 7.5% gel. 7 mL per sample. |
| Data analysis software | N/A | N/A | R or Python are suggested |
| Deionized water | N/A | N/A | Sufficient to prepare stain and agar. If unavailable, tap should be fine. |
| Desktop computer | N/A | N/A | Image analysis is not CPU intensive, any 'ordinary' desktop computer circa 2017 should be sufficient. |
| External hard drive | Seagate | STEB5000100 | Not fully required, but extremely useful given the number an size of images. 2 or more TB of storage suggested. |
| FIJI | NIH | version 1.51d | Version is ImageJ core. Plugins are updated as of writing. Available at: https://imagej.net/Fiji/Downloads |
| GIT | Open Source | version 2.19.1 or later | Available at: https://git-scm.com/ |
| Image capture software | ToupView | version 3.7.5177 | Any compatible with camera, may come with camera. Should allow saving TIFF images with spatial calibration data. |
| Mechanical (X/Y) Stage | OMAX | A512 | Not fully required, but greatly aids image acquisition. |
| Methylene blue | Fisher | M291-100 | Solid, to prepare 1% w/v solution. 5 uL solution per sample. |
| Microscope camera | OMAX | A35140U | Any digitial camera compatible with microscope. Resolution providing at least 5 um per pixel at 10x magnification and a dynamic range of at least 8 bits per pixel per color channel is suggested. |
| Optical Stage Micrometer | OMAX | A36CALM1 | Or otherwise sufficient for spatial calibration. |
| Petri dish, 100 mm | Fisher | FB0875712 | 1 per sample. |
| PPE | N/A | N/A | Standard lab coat, gloves, and eyewear. |
| Sparmoria macro | NCSU | version 0.2.1 | Available at github repository : https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis |
| Stereo/dissecting microscope | Nikon | SMZ-2T | Should provide 10 to 20x magnficiation and allow digital photos either with a buit-in camera or profide a mounting point for a CCD. |
References
- Show, K. Y., Lee, D. J., Tay, J. H. Aerobic granulation: Advances and challenges. Applied Biochemistry and Biotechnology. 167 (6), 1622-1640 (2012).
- Adav, S. S., Lee, D. -. J., Show, K. -. Y., Tay, J. -. H. Aerobic granular sludge: Recent advances. Biotechnology Advances. 26 (5), 411-423 (2008).
- Initial Investigations of Aerobic Granulation in an Annular Gap Bioreactor. North Carolina State University Available from: https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/2162 (2004)
- . Effect of Hydrodynamics on Aerobic Granulation Available from: https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/8761 (2012)
- Tay, J. H., Liu, Q. S., Liu, Y. Microscopic observation of aerobic granulation in sequential aerobic sludge blanket reactor. Journal of Applied Microbiology. 91 (1), 168-175 (2001).
- Kelly, R. N., et al. Graphical Comparison of Image Analysis and Laser Diffraction Particle Size Analysis Data Obtained From the Measurements of Nonspherical Particle Systems. AAPS Pharm SciTech. 7 (3), E1-E14 (2006).
- Walisko, R., et al. The Taming of the Shrew -Controlling the Morphology of Filamentous Eukaryotic and Prokaryotic Microorganisms. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 149, 1-27 (2015).
- Campbell, R. A. A., Eifert, R. W., Turner, G. C. Openstage: A Low-Cost Motorized Microscope Stage with Sub-Micron Positioning Accuracy. PLoS ONE. 9 (2), e88977 (2014).
- Dias, P. A., et al. Image processing for identification and quantification of filamentous bacteria in in situ acquired images. BioMedical Engineering OnLine. 15 (1), 64 (2016).
- Liao, J., Lou, I., de los Reyes, F. L. Relationship of Species-Specific Filament Levels to Filamentous Bulking in Activated Sludge. Applied and Environmental Microbiology. 70 (4), 2420-2428 (2004).
- Cromey, D. W. Avoiding twisted pixels: ethical guidelines for the appropriate use and manipulation of scientific digital images. Science and Engineering Ethics. 16 (4), 639-667 (2010).
- Wickham, H. Tidy Data. Journal of Statistical Software. 59 (10), (2014).
- van Rossum, G. . Python tutorial. , (1995).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E. FIJI: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- . SParMorIA: Sludge Particle Morphological ImageAnalysis Available from: https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis (2018)
- Ferreira, T., Rasband, W. . ImageJ User Guide: IJ 1.42 r. , (2012).
- Sezgin, M., Sankur, B. Survey over image thresholding techniques and quantitative performance evaluation. Journal of Electronic Imaging. 13 (1), 146-166 (2004).
- Kröner, S., Doménech Carbó, M. T. Determination of minimum pixel resolution for shape analysis: Proposal of a new data validation method for computerized images. Powder Technology. 245, 297-313 (2013).
- McKinney, W. Data Structures for Statistical Computing in Python. Proceedings of the 9th Python in Science Conference. , 51-56 (2010).
- Waskom, M., et al. . seaborn: v0.5.0 (November 2014). , (2014).
- . dplyr: A Grammar of Data Manipulation Available from: https://cran.r-project.org/web/packages/dplyr/index.html (2016)
- Riley, R. S., Ben-Ezra, J. M., Massey, D., Slyter, R. L., Romagnoli, G. Digital Photography: A Primer for Pathologists. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 18 (2), 91-128 (2004).
- Singh, S., Bray, M. A., Jones, T. R., Carpenter, A. E. Pipeline for illumination correction of images for high-throughput microscopy. Journal of Microscopy. 256 (3), 231-236 (2014).
- Eastwood, B. S., Childs, E. C. Image Alignment for Multiple Camera High Dynamic Range Microscopy. Proceedings. IEEE Workshop on Applications of Computer Vision. , 225-232 (2012).
- High Dynamic Range Microscopy for Cytopathological Cancer Diagnosis. IEEE Journal of Selected Topics in Signal Processing (Special Issue on: Digital Image Processing Techniques for Oncology) Available from: https://www.lfb.rwth-aachen.de/en/ (2009)
- Jain, V., et al. Supervised Learning of Image Restoration with Convolutional Networks. 2007 IEEE 11th International Conference on Computer Vision. , 1-8 (2007).
