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의학

Modelo preclínico de isquemia de extremidades traseras en conejos diabéticos

Published: June 02, 2019
doi:
10.3791/58964
, , , , , ,
1Department of Biomedical Engineering,University of Texas at Austin, 2Division of Cardiology,University of Texas McGovern Medical School, 3Center for Laboratory Animal Medicine and Care,UT Health Science Center at Houston, 4Memorial Herman Heart and Vascular Center,Texas Medical Center, 5Institute for Cellular and Molecular Biology,University of Texas at Austin, 6The Institute for Computational Engineering and Sciences,University of Texas at Austin, 7Institute for Biomaterials, Drug Delivery and Regenerative Medicine,University of Texas at Austin

Summary

Describimos un procedimiento quirúrgico utilizado para inducir isquemia periférica en conejos con hiperlipidemia y diabetes. Esta cirugía actúa como un modelo preclínico para afecciones experimentadas en la enfermedad arterial periférica en pacientes. La angiografía también se describe como un medio para medir la magnitud de la isquemia introducida y la recuperación de la perfusión.

Abstract

La enfermedad vascular periférica es un problema clínico generalizado que afecta a millones de pacientes en todo el mundo. Una consecuencia importante de la enfermedad vascular periférica es el desarrollo de la isquemia. En casos severos, los pacientes pueden desarrollar isquemia de extremidades críticas en la que experimentan dolor constante y un mayor riesgo de amputación de las extremidades. Las terapias actuales para la isquemia periférica incluyen cirugía de bypass o intervenciones percutáneas como la angioplastia con stent o aterectomía para restaurar el flujo sanguíneo. Sin embargo, estos tratamientos a menudo fallan en la progresión continua de la enfermedad vascular o reestenosis o están contraindicados debido a la mala salud general del paciente. Un enfoque potencial prometedor para tratar la isquemia periférica involucra la inducción de la neovascularización terapéutica para permitir que el paciente desarrolle vasculatura colateral. Esta red recién formada alivia la isquemia periférica restaurando la perfusión a la zona afectada. El modelo preclínico empleado con mayor frecuencia para la isquemia periférica utiliza la creación de isquemia de las extremidades traseras en conejos sanos a través de la ligadura de la arteria femoral. En el pasado, sin embargo, ha habido una fuerte desconexión entre el éxito de los estudios preclínicos y el fracaso de los ensayos clínicos con respecto a los tratamientos para la isquemia periférica. Los animales sanos suelen tener una regeneración vascular robusta en respuesta a la isquemia inducida quirúrgicamente, en contraste con la reducción de la vascularización y la regeneración en pacientes con isquemia periférica crónica. Aquí describimos un modelo animal optimizado para isquemia periférica en conejos que incluye hiperlipidemia y diabetes. Este modelo ha reducido la formación de colaterales y la recuperación de la presión arterial en comparación con un modelo con una dieta de colesterol más alta. Por lo tanto, el modelo puede proporcionar una mejor correlación con pacientes humanos con angiogénesis comprometida de las co-morbididades comunes que acompañan a la enfermedad vascular periférica.

Introduction

La enfermedad arterial periférica (PAD) es un trastorno circulatorio común en el que la progresión de la formación de placa aterosclerótica conduce a un estrechamiento de los vasos sanguíneos en las extremidades del cuerpo. El reciente aumento de los factores de riesgo de la aterosclerosis, incluyendo la diabetes, la obesidad y la inactividad, ha provocado un aumento de la prevalencia de la enfermedad vascular1. Actualmente, se estima que el 12% – 20% de la población general de más de 60 años de edad tiene enfermedad arterial periférica2. Una consecuencia importante de la enfermedad arterial periférica es el desarrollo de isquemia periférica, que se encuentra más comúnmente en las extremidades inferiores. En casos severos, los pacientes pueden desarrollar isquemia crítica de las extremidades, un estado en el cual hay dolor constante debido a la falta de flujo sanguíneo. Los pacientes con isquemia crítica de las extremidades tienen una probabilidad del 50% de que un miembro sea amputado dentro de un año de diagnóstico. Además, los pacientes con diabetes tienen una mayor incidencia de enfermedad arterial periférica y resultados más pobres después de intervenciones para revascularización3,4. Las terapias actuales para la isquemia periférica incluyen intervenciones percutáneas tales como aterectomía y colocación de stents o bypass quirúrgico. Sin embargo, para muchos pacientes estos tratamientos sólo proporcionan beneficios a corto plazo y muchos no son lo suficientemente sanos para los procedimientos quirúrgicos mayores. En este trabajo, describimos un modelo de animales preclínicos para la prueba de nuevos tratamientos dirigidos a la enfermedad vascular periférica que incorpora la generación de isquemia periférica en conejos a través de la ligadura quirúrgica en el contexto del estado de la enfermedad diabética.

El modelo de isquemia de las extremidades traseras en conejos se ha utilizado como un modelo fisiológico para la enfermedad vascular obstructiva y precursor preclínico de estudios en humanos durante más de medio siglo5,6. Los conejos son a menudo una especie preferida para estudios sobre isquemia periférica debido a la musculatura desarrollada del músculo del tobillo y de la pantorrilla, en contraste con los modelos animales grandes comunes que son unguatos (animales con pezuñas). Varios comentarios recientes han abordado el uso de este modelo y otros en el modelado de la enfermedad vascular periférica en los seres humanos7,8. Modelos similares utilizando isquemia de los miembros posteriores en conejos se utilizaron en estudios preclínicos de factores de crecimiento9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20, terapia génica21,22,23, 24,25,26,27,28,29,30,31,32, 33,34,35,36,37,38,39,40,41, 42,43,44y células madre45,46,47,48,49,50 ,51para la neovascularización terapéutica en las extremidades. Desafortunadamente, los ensayos clínicos que siguieron a estos exitosos estudios en animales no muestran beneficios significativos para los pacientes52.

Una explicación sugerida de la razón de este fracaso traslacional es que la condición de isquemia periférica en pacientes humanos es aquella que incluye resistencia a las señales angiogénicas53,54,55, 56 , 57 , 58 , 59. varios estudios han demostrado defectos en las vías de señalización angiogénicas en la diabetes y la hiperglucemia. La diabetes y la hiperlipidemia conducen a una pérdida de proteoglicanos de sulfato de heparán y un aumento en las enzimas que cortan el sulfato de heparán, presentando un mecanismo potencial para la resistencia a la angiogénesis/Arteriogénesis terapéutica con factores de crecimiento60 , 61. por lo tanto, una característica clave de un modelo de isquemia periférica debe incluir un aspecto de resistencia terapéutica para que las terapias puedan evaluarse en el contexto del estado de la enfermedad presente en pacientes humanos.

En este trabajo, describimos un modelo de conejo de isquemia periférica a través de la ligadura quirúrgica de las arterias femorales. En el modelo se incorpora un período de introducción con la inducción de la diabetes y la hiperlipidemia. Comparamos este modelo con otro modelo que incorpora una dieta más alta en grasas sin diabetes y descubrió que el modelo con diabetes y menor nivel de hiperlipidemia fue más eficaz en la reducción del crecimiento de los vasos sanguíneos. Nuestro modelo combina avances que han sido utilizados por grupos separados, con el objetivo de proporcionar un método práctico y estandarizado para lograr resultados consistentes en la investigación de enfermedades vasculares periféricas.

Protocol

Se realizaron estudios con animales con la aprobación de la Universidad de Texas en Austin y el centro de Ciencias UTHealth en el Comité institucional de cuidado y uso de animales de Houston (IACUC), la oficina de revisión de cuidado y uso de animales (ACURO) del ejército de los Estados Unidos Investigación médica y oficina de comando de materiales de protección de investigación, y de acuerdo con las pautas de NIH para el cuidado de animales. 1. inducción de la diabetes y la hiperlipide…

Representative Results

Después de la inducción de la diabetes y el inicio de la dieta de colesterol 0,1%, el colesterol total para los conejos con diabetes y la dieta de colesterol fue de 123,3 ± 35,1 mg/dL (n = 6 conejos masculinos) promedió los puntos de tiempo totales y conejos. El nivel de BGL para estos conejos fue de 248,3 ± 50,4 mg/dL (n = 6 conejos masculinos). En la figura 3 , en comparación con los conejos bajo una dieta de colesterol más alta (1% de colesterol), se muestra un …

Discussion

Hemos presentado un modelo preclínico para inducir isquemia de los miembros posteriores en conejos con diabetes e hiperlipidemia. En muchos estudios, hay ambigüedad en la técnica utilizada para crear isquemia de los miembros posteriores en conejos. En ratones, la severidad y la recuperación de la isquemia de los miembros posteriores depende en gran medida de la ubicación de la ligadura y la técnica utilizada para inducir la isquemia. La importancia de la técnica presentada en este trabajo es que permite la inducci…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores reconocen con gratitud el financiamiento a través del programa de investigación dirigida por el Congreso del Departamento de defensa (DOD CDMRP; W81XWH-16-1-0582) a ABB y RS. Los autores también reconocen la financiación a través de la Asociación Americana del corazón (17IRG33410888), el CDMRP DOD (W81XWH-16-1-0580) y los institutos nacionales de salud (1R21EB023551-01; 1R21EB024147-01A1; 1R01HL141761-01) a ABB.

Materials

0.9% Sodium Chloride Henry Schein Medical 1537468 / 1531434 250 mL bag / 1000 mL irrigation btl
1 mL Syringe VWR BD309628
10 mL Syringe VWR BD309695
10% Formalin Fisher-Scientific 23-245684
18G Needle VWR 89219-294
20G Needle VWR 89219-340
25G Needle VWR 89219-290
27G Needle VWR 89219-288
5 mL Syringe VWR BD309646
5% Dextrose Patterson Veterinary 07-800-9689
Acepromazine Patterson Veterinary VEDC207
Alfaxalone Patterson Veterinary 07-891-6051
Alginate Sigma-Aldrich PHR1471-1G
Alloxan Monohydrate Sigma-Aldrich A7413
Angiography Equipment Toshiba Infinix-i
Angiography Injector Medrad
Anti-Mouse Ab Alexa 594 Thermo Fisher Scientific A-11032 Secondary Antibody for IHC
Anti-Rabbit Ab Alexa 488 Thermo Fisher Scientific A-11008 Secondary Antibody for IHC
a-SMA Antibody Abcam ab5694 Primary Antibody for IHC
Baytril Bayer Animal Health 724089904201 Enrofloxacin
Blood Chemistry Panel IDEXX 2616 Rabbit Panel
Blood Pressure Cuff WelchAllyn Flexiport Disposable BP Cuff-infant size 7
Blood Pressure Monitor Vmed Technology Vmed Vet-Dop2
Bupivacaine Henry Schein Medical 6023287
Buprenorphine Patterson Veterinary 42023017905
Buprenorphine SR ZooPharm
Calcium Sulfate CB Minerals Food and Pharmaceutical Grade USP and FCC
Chlorhexidine Scrub Patterson Veterinary 07-888-4598
Chloroform Fisher-Scientific C298-4
Cholesterol Sigma-Aldrich C8503
DAPI Thermo Fisher Scientific 62248
Ear Vein Catheter Patterson Veterinary SR-OX165 Surflo IV catheters
Endotracheal tube Patterson Veterinary Sheridan Brand, Depends on Rabbit Size
Glucometer Amazon B001A67WH2 Accu-Chek Aviva
Glucometer Test Strips McKesson Medical-Surgical 788222 Accu-Chek Aviva Plus
Guidewire Boston Scientific 39122-01
Hair Clippers Amazon B000CQZI3Q Oster #40 blade
Heating Pad Cincinnati Subzero 273
Heating Pad Pump Gaymar Gaymar T/Pump
Hemostat Fine Science Tools 13009-12 Curved Mosquito Hemostat
Heparin Patterson Veterinary
Insertion Tool Merit Medical Systems MAP550 metal wire insertion tool
Insulin HPB Pharmacy Novalin R & Novalin N
Insulin Syringes McKesson Medical-Surgical 942674
Introducer Cook Medical G28954 3F Check Flo Performer Introducer
Isoflurane Henry Schein Medical 1100734
Ketamine Patterson Veterinary 856440301
Lactated Ringers McKesson Medical-Surgical 186662
Lidocaine McKesson Medical-Surgical 239936
Lidocaine/Prilocaine cream McKesson Medical-Surgical 761240
Ligaloop V. Mueller CH117 / CH116 White Mini / Yellow Mini
Mazola Corn Oil Amazon B0049IIVCI
Medrad Syringe McKesson Medical-Surgical 346920 150 mL
Meloxicam Patterson Veterinary
Metal ball sutures Ethicon-Johnson & Johnson K891H 4-0 silk C-1 30"
Metzenbaum Scissors Fine Science Tools 14019-13
Midazolam Henry Schein Medical 1215470
Nitroglycerin McKesson Medical-Surgical 927528
PECAM Antibody Novus Biologicals NB600-562 Primary Antibody for IHC
Perfusion Pump Masterflex
Pigtail Catheter Merit Medical Systems 1310-21-0053 3F pigtail
Polydioxanone (PDS II) suture McKesson Medical-Surgical 129271 4-0 taper RB-1 (needle comes on suture)
Polydioxanone (PDS II) suture McKesson Medical-Surgical 129031 4-0 reverse cutting FS-2
Polyglactin 910 (Vicryl) suture Butler 7233-41 3-0 taper RB-1
Polyglactin 910 (Vicryl) suture McKesson 104373 4-0 reverse cutting FS-2
Rabbit Chow (Alfalfa) LabDiet 5321
Rabbit Restrainer VWR 10718-000
Rib Cutters V. Mueller
Scalpel Fine Science Tools 10003-12
Scalpel Blade Fine Science Tools 10015-00 #15 blade
Silk Sutures Ethicon-Johnson & Johnson A183H 4-0 silk ties 18"
Stainless Steel Ball McMaster-Carr 1598K23 3-mm diameter
Surgical Drapes Gepco 8204S
Syringe Pump DRE Veterinary Versaflow VF-300
Visipaque contrast media McKesson Medical-Surgical 509055
Weitlaner Retractor Fine Science Tools 17012-13
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Sligar, A. D., Howe, G., Goldman, J., Felli, P., Karanam, V., Smalling, R. W., Baker, A. B. Preclinical Model of Hind Limb Ischemia in Diabetic Rabbits. J. Vis. Exp. (148), e58964, doi:10.3791/58964 (2019).
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