배아 조직과 Thymus 예제를 사용 하는 메 추 라 기-닭고기 공상 기관의 형성의 절연

Summary

이 문서에는 ex vivo 공상 장기 형태로 결합 될 수 있는 메 추 라 기 및 닭 배아에서 순수 배아 조직 분리 하는 방법을 제공 합니다.

Abstract

배아 조직 분리 용량 차례로 발달 생물학에서 공개 키 프로세스에 확실 한 공헌을 제공 했다 메 추 라 기-치킨 키메라 시스템을 설정 하기 위한 필수적인 단계를 했다.

여기는 메 추 라 기를 미세 및 그것의 생물 학적 속성을 유지 하면서 효소 소화에 의해 닭 배아 조직 분리 하는 최적화 된 방법 설명. 절연, 후 48 헤 메 추 라 기에 대 한 생체 외에서 organotypic 분석 결과에서 두 종에서 조직 관련 및 닭고기 조직 고유 핵 기능 및 분자 마커 사이 세포 잡담 연구를 수 있도록 하 여 차별 수 있습니다. heterospecific 협회 조직입니다. 이 접근은, 그러므로, 공부는 foregut의 형성과 pharyngeal morphogenesis 동안 발생 등 매우 역동적인 공간 수정, 개발 프로세스에 복잡 한 조직 상호 작용을 위한 유용한 도구 endoderm 파생 된 기관입니다. 이 실험적인 접근 thymus 형성의 초기 단계 동안 엽 상피 상호 작용 연구를 처음 개발 되었다. 이, 미래의 thymic rudiment endoderm 파생 및 mesoderm 파생 mesenchyme는 각각 메 추 라 기 및 닭 배아에서 분리 했다.

용량의 관련된 조직 기관 생성 하는 더 닭 배아의 chorioallantoic 막 (CAM)에 접목 하 여 테스트할 수 있습니다. 캠은 영양분을 제공 하 고 explanted 조직에 가스 교류를 허용 한다. 비켜 개발에서의 10 일 후 공상 장기 기존의 형태학 방법으로 수확된 explants에 분석 수 있습니다. 이 절차 또한 수 있습니다 초기 개발 (생체 외에서 개발)에서 기관 형성 동안 조직 관련 기여를 공부 (비켜 개발)에서 organogenesis의 최종 단계에.

마지막으로, 향상 된 격리 방법 또한 제공 한다 3 차원으로 (3D) 보존 배아 조직, 조직 관련 유전자 발현 패턴의 고해상도 지형 분석에도 사용할 수 있습니다.

Introduction

1970 년대 초반에 우아한 메 추 라 기-치킨 키메라 시스템 르 Douarin, 새로운 수익원 개발^1,2중 세포 이동과 세포 상호 작용의 역할을 이해 하 여에 의해 개발 되었다. 모델 두 종 사이의 셀 교환 것 크게 embryogenesis, 나중에 긴장의 형성 하 고는 조 혈을 포함 하 여 수많은 발달 과정을 연구 하는 데 사용 하는 경우 확인을 방해 하지 않는 전제에서 고안 되었다 시스템¹. 예를 들어 후자 복용, 조 혈 창시자 thymic 상피 rudiment 식민지의 주기적 파도 처음 관찰 되었다 메 추 라 기-치킨 키메라 시스템³를 사용 하 여. Thymus, 세 번째 및 네 번째 pharyngeal 주머니 (3/4PP) endoderm의 미래의 영토 15-30 somite 단계 [배아 일 (전자) 1.5-E2.5]에서 기계적 및 효소 메 추 라 기 (q) 배아에서 분리 했다. 이러한 단계는 닭고기 햄버거와 해밀턴⁴ (HH)-단계 12 월 17 일에 해당합니다. 격리 절차 트립 신 효소 연결 된 mesenchyme에서 endoderm 해리를 사용 하 여 시작 했다. 격리 된 endoderm E3-E3.5 (HH-단계 20-21)에서 호스트 치킨 (c) 태아의 somatopleura 지역에 투입 했다. 이 분리 mesenchyme thymic 상피 개발 기관 형성³에 기여를 "허용"으로 간주 되었다. 그 후, 닭고기 호스트 혈액을 매개로 조상 세포의 물결이 침투 메 추 라 기 기증자 thymic 상피 대응 호스트 태아³thymus 형성에 기여.

최근에,이 접근의 수정된 된 버전의 초기 단계-thymus 형성⁵엽 상피 상호 작용을 공부에 대 한 중요 한 것 또한 입증 되었다. 이 점에서 공상 배아³ 에서 소성 thymus의 형성에 관련 된 조직 모두 기증자와 호스트 배아에서 분리 되었고 비보 전 관련. 메 추 라 기 3/4PP endoderm (E2.5-E3)와 치킨 somatopleura mesoderm (E2.5-E3)를 분리 하는 향상 된 프로토콜 사용 되었다. 간단히, 배아 조직 했다 생체 외에서 pancreatin 소화 및 미세 하 여 격리 된. 또한, 효소 소화 조건, 온도 시간 외피의 조직 유형 및 발달 단계 (표 1)에 따라 최적화 했다.

다음, 고립 된 조직 했다 관련 한 organotypic에서 48 h에 대 한 시험관 시스템에서 이전에 보고 된^5,6. 조직의 생체 외 협회 vivo에서 조작의 몇 가지 제한 사항이 극복 배아에서 지방 세포 상호 작용을 모방 합니다. 이 시스템은 특히 유용 인 두 장치 개발 등 복잡 한 morphogenic 이벤트에서 세포 상호 작용을 공부.

Thymus histogenesis 각 조직의 기여 뿐만 아니라 한 thymus를 생성 하는 heterospecific 협회의 능력 더 탐험을 사용 하 여 캠 방법론, 이전 자세한^5,,78일 수 있다. 간결, 교양된 조직 cE8 배아의 캠에 융합 되었고 10 일 비켜 개발 수 있습니다. 다음, thymus 형성 수확된 explants에서 형태소 분석에 의해 평가 되었다. 클래식 메 추 라 기-치킨 연구³, 메 추 라 기 thymic 상피 조상 조 혈 모 세포 (HPCs) 나중 장기 개발^{9,10 보여 줬던 닭 배아에서 파생 된에 의해 식민지 화 되었다} . HPCs 매우 vascularized 캠^5,,78소성 공상 thymus 태아에서 마이그레이션. 메 추 라 기 파생된 thymic 상피 immunohistochemistry 종의 항 체 (즉, QCPN-MAb 메 PeriNuclear), 조직 관련 분자 마커를 위한 필요를 극복을 사용 하 여 확인할 수 있습니다

이 실험 방법은 이전 간행물⁸, 보고 2 단계 접근 체 외 중 고 비켜 개발에 약리학 대리인의 일반 관리 여 신호 통로의 변조를 허용 합니다. 또한, explants 실험⁸과정의 어떤 시간 시점에서 수확 될 수 있습니다.

마지막으로, 여기 상세한 격리 프로토콜 수 자연 속성의 보존 및 배아 조직, 그렇지 않으면 배아 영토의 현장에서 유전자 발현 패턴을 자세하게 설명 하는 데 특히 유용의 3D 아키텍처에 의해 액세스할 수 전통적인 방법입니다. 또한, transcriptome 분석 접근, RNA-seq 또는 microarrays를 포함 하 여 적용할 수 있습니다 또한 고립 된 조직에서 조직 관련 높은 처리량 "omics" 분석을 제공 하면서 유전자 마커를 필요로 하지 않고.

Protocol

이러한 모든 실험 동물 관리 및 센트 Académico 드 메디 시 나의 윤리적 지침 따라 리스보아.

1. 수정 된 메 추 라 기 그리고 닭 계란 외피

1. 장소는 3 일 동안 38 ° C 습도 인큐베이터에서 일본 메 추 라 기 (Coturnix coturnix japonica)의 알을 수정 된. 공기 챔버에 향하도록 계란 (계란 무뚝뚝한 끝)를 품 어.
   참고: 습도 환경 인큐베이터의 밑에 물 컨테이너를 배치 하 여 이루어집니다.
2. 38 ° C 습도 인큐베이터에 2.5 일 동안 치킨 (갈 루스 갈 루스)의 수정 된 알을 품 어. 수평 위치에 알 품 어 고 상부 태아 위치를 식별할 수 숯불의 한 조각을 사용 하 여 표시 합니다.
   참고:이 실험을 설정할 때 40 메 추 라 기 계란과 60 닭고기 달걀으로 시작.

2. 격리의 메 추 라 기 endoderm thymic rudiment의 예비 도메인을 포함 하

참고: 메 마른 조건에서 수평 층 류 두건 및 멸 균된 악기와 계란 조작 절차에 대 한 자료를 사용 합니다.

1. Thymic rudiment의 추정 영역을 포함 하는 배아 지역 제거, 3^층 및 4^회 를 포함 하는 인 두 아치 지역 설명된^7,8로 (3/4PAR), 아치.
   1. 큰 붕 규 산 유리 그릇 (100 x 50 mm, 100 cm³) 차가운 인산 염 버퍼 염 (PBS) 60 mL을 채우십시오.
   2. 곡선된가 위의 도움으로 누르고 잘라 원형 구멍을 메 추 라 기의 껍질에 계란을 3 일 동안 incubated 되었습니다. 무딘 계란의 반대 측에 있는 구멍을 확인 하 고 차가운 PBS와 그릇에 노 른 자 (태아)와 전송.
   3. 여분의 배아 선박 곡선된가 위를 사용 하 여 외부 vitelline 멤브레인을 절단 하 여 노 른 자에서 태아를 제거 합니다.
   4. 얇은 겸의 도움으로, 작은 사 발 (60 m m x 30 m m, 15 cm³) 배아 전송 차가운 PBS의 10 mL으로 가득합니다.
   5. 스키 머, 100 mm 페 트리 접시 블랙 기지와 태아 이동 ( 재료의 표참조) 차가운 PBS의 10 mL를 포함 하 고 있는 stereomicroscope에서.
   6. 앞에서 설명한⁸3/4PAR를 해 부.
   7. Aspirate 3/4PAR 및 유리 접시 4 분의 3에 가득 찬 PBS 2 mL 살 균 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여.
2. Thymic rudiment (3/4PP endoderm)의 추정 영토를 포함 하는 pancreatin와 효소 소화에 의해 endoderm를 격리 합니다.
   1. 주걱과 얇은 겸의 도움으로 유리 접시 3/4 3/4PAR 이동 찬 pancreatin (8 mg/mL; 25 mg/mL 차가운 PBS와의 1:3 희석)으로 가득합니다.
   2. 효소 소화에 대 한 얼음에 1 시간에 품 어.
      참고: 소화 효소의 시간 개발 (표 1)의 무대의 따라 달라 집니다.
   3. 3/4PAR에서 endoderm을 stereomicroscope (40 x-60 배 확대)에서 유리 접시를 놓습니다.
      참고: 모든 표면 및 유지 솔루션 감기이 절차 동안에. 해 부 조직 하는 데 시간이 오래 복용 하는 경우 새로운 차가운 pancreatin 솔루션 변경 (> 15 분). 조명 원으로 통합 또는 광학 섬유는 stereomicroscope에서 제한 된 열 부하를 고려 하는 LED 빛을 사용 합니다.
   4. 주변 조직에서 endoderm를 격리 하려면 핀 홀더 2 개의 스테인레스 스틸 microscalpels 사용 하 여.
      참고: microscalpels를 사용 하 여 턱 오프닝 직경 1 m m 0 m m의 직경이 0.1 m m와 0.2 m m 니켈 핀 홀더 사이.
      1. 먼저 신경 튜브 및 mesoderm pharyngeal endoderm의 등 쪽 표면에 연결을 제거 합니다.
      2. 최대 지 면, 신중 하 게 분리 및 제거 인 두 아치 사이 mesenchyme 고 노출 인 두 파우치. 3/4PAR의 양쪽에서이 절차를 수행 합니다.
      3. 심장 관 및 mesenchyme 둘러싼 앞쪽 주머니를 제거 합니다.
      4. 복 부 쪽으로 2^차 및 3^rd 인 두 아치 ectoderm 잘라내어 mesenchyme는 파우치에 연결 된를 조심 스럽게 제거. 3/4PAR의 다른 측면에서이 절차를 반복 합니다. 이 단계에서 갑 상선 rudiment 표시 되어야 합니다.
      5. 두 개의 microscalpels와 인 두 endoderm에 연결 된 모든 나머지 중간 엽 세포를 제거 합니다.
      6. 2^차 및 3^rd 3^rd 및 갑 상선 rudiment 및 2^nd endoderm의 앞쪽 부분에서 4^번째 파우치 포함 하 인 두 endoderm 해리 PP 사이 횡단 컷 만들기 인 두 주머니입니다.
      7. 주걱과 얇은 겸의 도움으로 전송 격리 3/4PP endoderm 유리 접시 4 분의 3에 100% 찬 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)으로 가득합니다.
3. 생체 외 분석 실험의 준비 하는 동안 얼음에 고립 된 조직 유리 접시를 유지. 또는 격리 된 조직을 3 차원으로 보존 될 수 하 고 현장에서 유전자 발현에 대 한 분석.

3입니다. 치킨 somatopleura mesoderm의 격리

참고: 수행 계란 수평 층 류 두건 및 소독된 기기 및 자료를 사용 하 여 무 균 상태에서 조작 절차.

1. Somites 19-24 (ss19-24)의 수준에서 somatopleura mesoderm 포함 된 배아 영토를 제거 합니다.
   1. 외피의 2.5 일 후 인큐베이터에서 닭 계란을 제거 합니다.
   2. 곡선가 위, 껍질에 작은 구멍을 엽니다. 바늘을 삽입 하 고 낮은 알 부 민 달걀 내부 볼륨 (포탄의 표시 영역 아래에 있는) 태아의 손상을 방지 하는 10 mL 주사기와 알 부의 2 개 mL를 발음. 발음된 알 부 민을 삭제 합니다.
   3. 컷 원형 곡선된가 위를 사용 하 여 셸 표시 된 지역에 (최대-3 분의 2는 상단 표면 영역)를 구멍.
   4. 잘라 vitelline 막 외부 extraembryonic 배 얇은 집게로 태아를 잡고 있는 동안.
   5. Stereomicroscope에서 차가운 PBS의 10 mL를 포함 하는 검은 기지와 태아 100 mm 페 트리 접시에에서 놓습니다.
      참고:이 시점에서 stereomicroscope를 사용 하 여 미세 절차의 점진적 확대에 대 한.
   6. 접시의 바닥에는 배아를 4 개의 얇은 곤충 핀을 사용 합니다. 사각형 모양을 형성 하는 extraembryonic 지역에 핀을 배치 합니다.
   7. 19와 24 transversely 배아 축 somites wecker 눈이 위를 사용 하 여 모든 배아 영토를 건너 사이 두 컷을 수행 합니다.
   8. 한계 배아 가장자리 절단 ss19-24, 배아 섹션을 놓습니다.
   9. Aspirate ss19 24 조직 및 유리 접시 4 분의 3에 차가운 PBS 2 mL 살 균 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 채워집니다.
2. Pancreatin (8 mg/mL; 25 mg/mL 차가운 PBS와의 1:3 희석)와 효소 소화에 의해 somatopleura 지역 (ss19-24)에서 측면 mesoderm를 격리 합니다.
   1. 주걱과 얇은 집게, 전송의 도움으로 유리 ss19 24 조직 접시 가득 찬 pancreatin 솔루션으로 3/4.
   2. 효소 소화에 대 한 얼음에 30 분 동안 품 어.
   3. Stereomicroscope, 아래에 홀더 2 개의 microscalpels를 사용 하 여 주변 조직에서 mesoderm을 격리 합니다.
      참고: 모든 표면 및 유지 솔루션 감기이 절차 동안에. 해 부 조직 하는 데 시간이 오래 복용 하는 경우 새로운 차가운 pancreatin 솔루션 변경 (> 10 분.). 조명 원으로 통합 또는 광학 섬유는 stereomicroscope에서 제한 된 열 부하를 고려 하는 LED 빛을 사용 합니다.
   4. Mesoderm 격리 하는 동안 먼저 ectoderm ventrally 위치 splancnopleura 조직의 주의 초연 뒤 표면에서 제거 합니다.
   5. 릴리즈 신경 튜브를 병렬 동작에서 절단 하 여 somatopleura의 오른쪽 측면 mesoderm.
   6. 태아의 왼쪽의 mesoderm 분리를 반복 합니다.
      참고:이 절차 동안 microscalpel의 움직임을 느리게 합니다. 노출 된 엑스트라 세포 매트릭스 단백질 조직 및 유체 움직임을 방지 하는 악기에 충실.
   7. 주걱과 얇은 겸의 도움으로 유리 접시 4 분의 3에 전송 격리 mesoderm 차가운 FBS 가득합니다.
3. 생체 외 분석 실험의 준비 하는 동안 얼음에 고립 된 조직 유리 접시를 유지.

4입니다. 생체 외에서 organotypic 분석 결과: 메 추 라 기 3/4PP endoderm와 치킨 somatopleura mesoderm heterospecific 협회

1. 10 %FBS 1% 펜/Strep^3,5보충 RPMI 1640 매체와 문화 매체를 준비 합니다.
2. 35 mm 페 트리 접시 배양의 5 mL에에서 금속 그리드를 배치 합니다.
   참고: 격자의 상단 중간 표면을 액체의 과잉을 제거 합니다.
3. 얇은 포 셉의 도움으로 멤브레인 필터 문화 매체에와 공기와 접촉 한 표면에 그리드 위에 배치.
   참고: 1/4의 막 (13 m m 직경) 조직 협회에 대 한 적절 한입니다.
4. Stereomicroscope에서 멤브레인 필터 위에 고립 된 조직에 연결. 먼저 이식 숟가락 (또는 주걱)의 도움으로 부드러운 슬라이딩 유리 접시에서 3/4PP endoderm (2 단계)을 전송 하 고 얇은 집게. 격리 된 mesoderm (3 단계)에 대 한이 절차를 반복 합니다.
   참고:는 microscalpel의 도움으로의 그것의 협회를 극대화 하기 위해 조직 믹스.
5. 48 h. 교양된 조직 chorioallantoic 막 (CAM)에 투입 될 수에 대 한 신중 하 게 5% CO₂ 와 37 ° C에서 습도 인큐베이터에 관련된 조직 배치 합니다.
   참고: 카메라에 소성 기관 형성 이전 자세한⁸이었다.

Results

프로토콜에는 여러 세포 및 개발 생물학 기술 접근에 사용 되는 조류 배아 조직 분리 하는 방법을 자세히 설명 합니다. 이 방법은 이전 thymus 형성⁵의 초기 단계 동안 엽 상피 상호 작용을 공부 고용 되었다. 여기, 새로운 결과 그림 1 과 그림 2, 비슷한 방법을 사용 하 여 표시 됩니다.

Discussion

여기 상세한 배아 조직 격리 절차는 다른 생물학 문맥^3,,56에 메 추 라 기-닭고기 공상 배아를 생산 하는 이전 기술에서 개선 되었다.

이 방식은 유전자 조작 이나 결정, 유전자 변형된 동물 모델의 사용을 제한 하지는 조직의 특정 마커를 사용 하 여 필요 없이 순수 배아 조직 분리에 적합 합니다. 그것은 능?...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
닭 수정란 (Gallus gallus)	Pintobar, Portugal		가금류 농장
메추라기 수정란 (Coturnix coturnix)	Interaves, Portugal		Bird farm
15 mL PP 원심분리기 튜브	Corning	430052
50 mL PP 원심분리기 튜브	Corning	430290
60 x 20 mm 파이렉스 접시	Duran 그룹	21 755 41
100 x 20 mm 파이렉스 접시	Duran 그룹	21 755 48
메탈 그리드	Goodfellows		세밀한 메시  스테인레스 스틸 그리드
멤브레인 필터	Millipore	DTTP01300	0.6 mm Isopore 막 필터
페트리 디쉬, 35 x 10 mm	Sigma-Aldrich	P5112
60 x 30mm 파이렉스 그릇 (작은 크기)			슈퍼마켓에서
100 x 50mm 파이렉스 그릇 (대형 크기)			슈퍼마켓에서
트랜스퍼 피펫	Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific	2041S	2 mL 플라스틱 피펫
유리 파스퇴르 피펫	Normax	5426015
슈퍼마켓에서 판매하는 투명 플라스틱 테이프
사이토케라틴(팬, 산성 및 염기성, 유형 I 및 II 사이토케라틴), 클론 Lu-5	BMA Biomedicals	T-1302
Fetal Bovine Serum	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific		Standart FBS
Pancreatin	Sigma-Aldrich	P-3292	제조업체의 지침에 따라 25mg/mL 용액을 준비합니다. 분취 전에 원심분리기 및 여과를 하고 -20°C에서 보관하십시오. 분취액은 냉동 보관할 수 있습니다. 몇 년.
파라포름알데히드	Sigma-Aldrich	P6148
페니실린-스트렙토마이신	인비트로겐, Thermo Fisher Scientific	15140-122
인산염 완충 식염수 (PBS)	GIBCO, Thermo Fisher Scientific	10010023
QCPN 항체	개발 연구 하이브리도마 은행	QCPN
RPMI 1640 매체, GlutaMAX 보충제	GIBCO, Thermo Fisher Scientific	61870010
Bluesil RTV141A/B 실리콘 엘라스토머 1.1Kg 키트	ELKEM/Silmid	RH141001KG	페트리 디쉬를 위한 뒷받침을 준비하기 위해
Dumont #5 펜치	파인 사이언스 도구	11251-30	얇은 집게
매우 세밀한 Bonn 가위, 곡선	Fine Science Tools	14085-08	곡선형 가위
곤충 핀	Fine Science Tools	26001-30	0.3 mm 스테인리스 스틸 핀
마이크로 스패튤라	Fine Science Tools	10087-12	이식 스푼
Minutien 핀	Fine Science Tools	26002-20	0.2 mm 스테인레스 스틸 마이크로 메스
Minutien 핀	Fine Science Tools	26002-10	0.1 mm 스테인레스 스틸 마이크로 메스
Moria 니켈 도금 핀 홀더	Fine Science Tools	26016-12	니켈 도금 핀 홀더
Moria 천공 스푼	Fine Science Tools	10370-17	Skimmer
Wecker Eye Scissor	Fine Science Tools	15010-11
카메라	Leica Microsystems	MC170 HD
현미경	Leica Microsystems	DM2500
나노줌머  S360 디지털  슬라이드 스캐너	Hamamatsu Photonics	C13220-01
스테레오스코프	Leica Microsystems	라이카 M80