مقايسة اتصالات بين الخلايا مفرق الأصفر يوديد فلورسنت بروتين-الفجوة
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا مقايسة اتصالات بين الخلايا مفرق فجوة رواية المصممة للفرز الفائق الفجوة تقاطع تحوير المواد الكيميائية لاكتشاف المخدرات وتقييم السمية.
Abstract
هي تقاطعات الفجوة (جيس) غشاء الخلية القنوات التي تتيح نشر جزيئات أصغر من 1 كاتشين بين الخلايا المتجاورة. كما لديهم أدوار الفسيولوجية والمرضية، هناك حاجة إلى فحوصات الكشف (HTS) الفائق لتحديد المغيرون GJ في فحوصات علم السموم واكتشاف المخدرات. مقايسة اتصالات بين الخلايا مفرق (I يفب ججيك) رواية يوديد الأصفر فلوري بروتين، فجوة تلبي هذه الحاجة. وهو تحليل يستند إلى الخلية بما في ذلك الخلايا يقبلون والجهات المانحة التي صممت للتعبير عن ثابت متغير بروتين فلوري صفراء (يفب)، الذين fluorescence حساسية تطفئ يوديد، أو SLC26A4، الناقل يوديد، على التوالي. عندما تتم إضافة يوديد لثقافة مختلطة من أنواع الخلايا اثنين، التي تدخل الخلايا المانحة عبر الناقل SLC26A4 ومنتشر إلى الخلايا المجاورة يقبلون عبر ججس حيث أنهم إخماد fluorescence يفب. الأسفار يفب يقاس ببئر في وضع حركية. ويعكس معدل التبريد يفب GJ النشاط. المقايسة موثوق بها وسريعة ما يكفي لاستخدامها ل HTS. ويرد وصف البروتوكول للمقايسة يفب-جيك استخدام الخلايا LN215، والخلايا البشرية الدبقي،.
Introduction
الفجوة في تقاطعات (ججس) بمثابة قنوات بين الخلايا للسماح بنشر الجزيئات الصغيرة من < 1 كاتشين مثل المواد الغذائية ونواتج الأيض وجزيئات إرسال الإشارات بين الخلايا المتجاورة. تتضمن عناصر هالة هيميتشاننيل أو كونيكسون في كل خلية، ويشكل كل كونيكسون ستة كونيكسينس (ككسس)1. جيس وككسس قد استخدمت في فحوصات علم السموم من المواد المسببة للسرطان مثل الهيدروكربونات العطرية (PAH)، التي هي GJ مثبطات2،،من34. لقد ارتبطت جيك تعطلت مع نونجينوتوكسيك التسرطن5،6. كهدف علاجية محتملة، أبلغ عن مشاركة GJ في أنواع فرعية معينة من مضبوطات7،8، الحماية من القلب والمخ الاسكيمية/ضخه إصابة9، النصفي مع هالة10، إصابة الكبد الناجم عن المخدرات6،11، والجرح شفاء12. فحوصات الكشف (HTS) الفائق مطلوبة لتحديد المواد الكيميائية تحوير GJ أو الأجسام المضادة لاكتشاف العقاقير، لفحوصات علم السموم، وتحديد المنظمين الخلوية رواية GJ النشاط. يمكن أيضا استخدام فحوصات HTS للتحقيق في علاقات الهيكل والنشاط GJ المغيرون2،13،،من1415.
وتشمل بعض فحوصات ججيك نقل صبغ أو تقنيات المشبك التصحيح المزدوج. إبليس الأصفر CH (LY) واستر أسيتوكسيميثيل كالسين (كالسين-ص) قد استخدمت في فحوصات الصبغة والنقل. الخلايا غير المسامية للي، والتي يتم تقديمها بواسطة microinjection أو كشط تحميل انهانسر. مرة واحدة داخل الخلية، LY ينتشر في المجاورة الخلايا عن طريق جيس وهو جزيئي النشاط GJ بحجم الهجرة لي16. وعادة ما تنطوي فحوصات كالسين-ص الفجوة-الأسفار الانتعاش بعد17،فوتوبليتشينج18. كالسين-ص هو صبغة بيرمينت خلية التي يتم تحويل إينتراسيلولارلي إلى كالسين غير منفذة استراز جوهرية. المقايسة يتطلب مجهر [كنفوكل] لمراقبة نقل كالسين-صباحا في خلية من تلك المحيطة بأنه عقب الليزر فوتوبليتشينج. إذا كانت موجودة جيس الوظيفية، كالسين-صباحا في الخلايا المجاورة يدخل الخلايا فوتوبليتشيد ويتم استردادها الأسفار. هو جزيئي النشاط GJ بمدى الانتعاش الأسفار من الخلايا فوتوبلياتشيد. فحوصات الصبغة والنقل هي شاقة وتستغرق وقتاً طويلاً أو حساسيات منخفضة. لقط التصحيح المزدوج هو أسلوب الكهربية أن التدابير الموصلية هالة. أنها حساسة نسبيا، مع اعتماد مباشر من الموصلية في عدد جيس مفتوحة19؛ بيد أنه من الناحية الفنية تطالب، تستغرق وقتاً طويلاً ومكلفة20. وكان وضع مقايسة يفب-جيك لاستخدامها في HTS.
ويبين الشكل 1 المكونات والخطوات للمقايسة جيك-يفب، الذي يستخدم الخلايا يقبلون معربا عن متغير يفب يوديد حساسة إذ تضع H148Q و I152L (يفبQL) والخلايا المانحة معربا عن يوديد الناقل (SLC26A4)21 . تسمح الطفرات اثنين قام يفبQL تسقيه من الأسفار يوديد22. تتم إضافة اليود إلى يقبلون شارك مثقف وخلايا المانحين؛ لا تقم بإدخال الخلايا يقبلون، ولكنها هي التي تتناولها الناقلين SLC26A4 الحالي على الخلايا المانحة. اليود في الخلايا المانحة منتشر عبر جيس عاملة في خلايا يقبلون المجاورة حيث أنهم إخماد fluorescence يفبQL . إذا أغلقت جيس أو حظرها بواسطة مثبطات، لا يمكن إدخال يوديد الخلايا يقبلون لإخماد الأسفار. ويعكس معدل التبريد يفبQL GJ النشاط. إجراء المقايسة ججيك-يفب معقدة ولا تستغرق وقتاً طويلاً. وهو متوافق مع HTS ويمكن استخدامها لاختبار آثار عدد كبير من المركبات في النشاط GJ في فترة زمنية قصيرة نسبيا. أنه يتطلب فقط يقبلون وخلايا المانحين والحلين الملح متوازنة. البروتوكول هو موضح أدناه تستند إلى خلايا LN215 Cx الرئيسية التي يتم Cx4321. مستقبلات LN215-يفبQL و LN215–أنا− المانحة خلايا تم إنشاؤها بواسطة توصيل مع lentiviruses معربا عن21،يفبQL أو SLC26A423.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن استخدام التحليل يفب-جيك ل HTS لأنها قوية وسريعة وغير مكلفة. يعتبر فحص HTS قوية إذا Z ‘-عامل أعلى من 0.525. انظر تشانغ وآخرون للحصول على وصف للتحليل الإحصائي المستخدمة لتقييم مدى ملاءمة HTS فحوصات25. عندما تستخدم الخلايا LN215، Z ‘-كان عامل > 0.5 دون أي التحسين المقايسة. إذا ك?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا البحث كان يدعمها “البرنامج بحوث العلوم الأساسية” عبر الوطنية بحوث مؤسسة من كوريا (جبهة الخلاص الوطني) ممولة من وزارة التربية والتعليم (2011-0023701، 2016R1D1A1A02937397، و 2018R1A6A1A03023718).
Materials
| 96-well plate | SPL | 30096 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C5670 | I-solution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C-solution, I-solution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | sigma | 276855 | |
| HEPES | Sigma | RES6003H-B7 | C-solution, I-solution |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | transfection reagent |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2 6H2O) | Sigma | M2393 | C-solution |
| Microplate reader | BMG LabTech | POLARstar Omega 415-1618 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| Polybrene | sigma | H9268 | |
| Poly-L-lysine solution | sigma | P4707 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | C-solution, I-solution |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| Puromycin Dihydrochloride | sigma | P8833 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S5886 | C-solution, I-solution |
| Sodium hyroxide (NaOH) | Sigma | S2770 | |
| Sodium Iodide (NaI) | Sigma | 383112 | I-solution |
References
- Goodenough, D. a., Goliger, J. a., Paul, D. L. Connexins, connexons, and Intercellular Communication. Annual Review of Biochemistry. 65, 475-502 (1996).
- Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. Modulated Gap Junctional Intercellular Communication as a Biomarker of PAH Epigenetic Toxicity: Structure-Function Relationship. Environmental Health Perspectives. 106, 975 (1998).
- U, J. E. T., Chang, C., Upham, B., Wilson, M. Epigenetic toxicology as toxicant-induced changes in intracellular signalling leading to altered gap junctional intercellular communication. Toxicology Letters. , 71-78 (1998).
- Yamasaki, H. Role of disrupted gap junctional intercellular communications in detection and characterization of carcinogens. Mutation Research – Reviews in Genetic Toxicology. , (1996).
- Yamasaki, H., et al. Gap junctional intercellular communication and cell proliferation during rat liver carcinogenesis. Environmental Health Perspectives. 101, 191-197 (1993).
- Vinken, M., et al. Gap junctional intercellular communication as a target for liver toxicity and carcinogenicity. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 44, 201-222 (2009).
- Fonseca, C. G., Green, C. R., Nicholson, L. F. B. Upregulation in astrocytic connexin 43 gap junction levels may exacerbate generalized seizures in mesial temporal lobe epilepsy. Brain Research. 929 (1), 105-116 (2002).
- Garbelli, R., et al. Expression of connexin 43 in the human epileptic and drug-resistant cerebral cortex. Neurology. 76 (10), 895-902 (2011).
- Schulz, R., et al. Connexin 43 is an emerging therapeutic target in ischemia/reperfusion injury, cardioprotection and neuroprotection. Pharmacology and Therapeutics. 153, 90-106 (2015).
- Sarrouilhe, D., Dejean, C., Mesnil, M. Involvement of gap junction channels in the pathophysiology of migraine with aura. Frontiers in Physiology. , (2014).
- Patel, S. J., et al. Gap junction inhibition prevents drug-induced liver toxicity and fulminant hepatic failure. Nature Biotechnology. 30 (2), 179-183 (2012).
- Kandyba, E. E., Hodgins, M. B., Martin, P. E. A murine living skin equivalent amenable to live-cell imaging: analysis of the roles of connexins in the epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 128 (4), 1039-1049 (2008).
- Upham, B. L., et al. Differential roles of 2 , 6 , and 8 carbon ceramides on the modulation of gap junctional communication and apoptosis during carcinogenesis. Cancer Letters. 191, 27-34 (2003).
- Upham, B. L., et al. Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems. Environmental Health Perspectives. 117 (4), 545-551 (2009).
- Weis, L. M., et al. Bay or Baylike Regions of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Were Potent Inhibitors of Gap Intercellular Communication. Environmental Health Perspectives. 106 (1), 17-22 (1998).
- el-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-Loading and Dye Transfer: A Rapid and Simple Technique to Study Gap Junctional Intercellular Communication. Experimental Cell Research. 168 (2), 422-430 (1987).
- Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. Photobleaching Assay of Gap Junction- Mediated Communication Between Human Cells. Advancement of Science. 232 (4749), 525-528 (2010).
- Abbaci, M., et al. In vitro characterization of gap junctional intercellular communication by gap-FRAP technique. Proceedings of SPIE. , 585909 (2005).
- Neyton, J., Trautmann, A. Single-channel currents of an intercellular junction. Nature. 317 (6035), 331-335 (1985).
- Wilders, R., Jongsma, H. J. Limitations of the dual voltage clamp method in assaying conductance and kinetics of gap junction channels. Biophysical Journal. 63 (4), 942-953 (1992).
- Lee, J. Y., Choi, E. J., Lee, J. A new high-throughput screening-compatible gap junctional intercellular communication assay. BMC Biotechnology. 15 (1), 1-9 (2015).
- Galietta, L. J. V., Haggie, P. M., Verkman, A. S. Green fluorescent protein-based halide indicators with improved chloride and iodide affinities. FEBS Letters. 499 (3), 220-224 (2001).
- Lee, J. Y., Yoon, S. M., Choi, E. J., Lee, J. Terbinafine inhibits gap junctional intercellular communication. Toxicology and Applied Pharmacology. 307, 102-107 (2016).
- Hughes, J., Rees, S., Kalindjian, S., Philpott, K. Principles of early drug discovery. British Journal of Pharmacology. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Upham, B. L. Role of Integrative Signaling Through Gap Junctions in Toxicology. Current Protocols in Toxicology. , (2011).
- Schalper, K. A., et al. Modulation of gap junction channels and hemichannels by growth factors. Molecular BioSystems. 8 (3), 685-698 (2012).
- Kulkarni, G. V., Mcculloch, C. A. G. Serum deprivation induces apoptotic cell death in a subset of Balb / c 3T3 fibroblasts. Journal of Cell Science. 1179, 1169-1179 (1994).
- Harris, A. L., Locke, D. Permeability of Connexin Channels. Connexins. , 165-206 (2009).
- Choi, E. J., Yeo, J. H., Yoon, S. M., Lee, J. Gambogic Acid and Its Analogs Inhibit Gap. Junctional Intercellular Communication. 9, 1-10 (2018).
