En Iodid-gul fluorescerende proteiner-Gap Junction-intercellulær kommunikation Assay
Summary
Vi præsenterer her, en protokol for en roman gap junction intercellulær kommunikation assay designet til high throughput screening af gap junction-modulerende kemikalier for drug discovery og toksikologisk vurdering.
Abstract
Kløften vejkryds (GJs) er cellemembranen kanaler, der tillader diffusion af molekyler, mindre end 1 kDa mellem naboceller. Som de har fysiologiske og patologiske roller, er der behov for høj overførselshastighed screening (HTS) assays til at identificere GJ modulatorer i drug discovery og toksikologi assays. En roman Iodid-gul fluorescerende proteiner-gap junction-intercellulær kommunikation (I-YFP-GJIC) assay opfylder dette behov. Det er en celle-baserede analyse herunder acceptor og donor celler, der er manipuleret til at stabilt udtrykke en gul fluorescerende proteiner (YFP) variant, hvis Fluorescens er nænsomt bratkølet af Iodid, eller SLC26A4, en Iodid transporter, henholdsvis. Iodid er føjet til en blandingskultur af to celletyper, de angive donor celler via SLC26A4 transporter og diffuse til tilstødende acceptor celler via GJs hvor de slukke YFP fluorescens. YFP fluorescens måles godt af godt i en kinetisk tilstand. YFP dæmper sats afspejler GJ aktivitet. Analysen er pålidelig og hurtig nok til at blive brugt til HTS. Protokol for jeg-YFP-GJIC analyse ved hjælp af LN215 cellerne, humane gliom celler, er beskrevet.
Introduction
Kløften vejkryds (GJs) fungere som intercellulære kanaler at tillade diffusion af små molekyler af < 1 kDa som næringsstoffer, metabolitter og signalering molekyler mellem naboceller. De junctional elementer omfatter en hemichannel eller connexon i hver celle, og hvert connexon udgør seks connexins (Cxs)1. GJs og Cxs har været brugt i toksikologi assays af kræftfremkaldende stoffer såsom polycykliske aromatiske kulbrinter (PAH), som er GJ hæmmere2,3,4. Forstyrret GJIC har været forbundet med nongenotoxic carcinogenese5,6. Som potentielle terapeutiske mål, er GJ involvering blevet rapporteret i særlige undertyper af anfald7,8, beskyttelse mod hjerte og hjerne iskæmi/reperfusion skade9, migræne med aura10, Drug-induceret leverskade6,11, og sårheling12. Høj overførselshastighed screening (HTS) assays er forpligtet til at identificere GJ-modulerende kemikalier eller antistoffer for drug discovery, for toksikologi assays, og identificere roman cellulære regulatorer af GJ aktivitet. HTS assays kan også bruges til at undersøge struktur-aktivitet relationer af GJ modulatorer2,13,14,15.
Nogle GJIC assays omfatter dye transfer eller dobbelt patch klemme teknikker. Lucifer gule CH (LY) og calcein acetoxymethyl ester (calcein-AM) har været anvendt i dye-overførsel assays. Celler er ikke gennemtrængelige til LY, som er indført ved mikroinjektion, Skrab lastning eller elektroporation. Én gang inde i cellen, LY breder sig til omkringliggende celler via GJs og GJ aktivitet er analyseret af omfanget af LY migration16. Calcein-AM assays indebære normalt gap-fluorescens opsving efter photobleaching17,18. Calcein-AM er en celle-permeant farvestof, der omdannes intracellulært til uigennemtrængelige calcein af en iboende esterase. Analysen kræver en Konfokal mikroskop til at observere overførsel af calcein-AM i en celle fra dem omkring det efter laser photobleaching. Hvis funktionelle GJs er til stede, calcein-AM i tilstødende celler træder photobleached cellerne og Fluorescens er genoprettet. GJ aktivitet er analyseret af omfanget af fluorescens inddrivelse af photobleached celler. Dye-overførsel assays er besværlig og tidskrævende eller har lav følsomhed. Dobbelt patch fastspænding er en elektrofysiologiske metode, der måler junctional ledningsevne. Det er relativt følsomme, med en direkte afhængighed af ledningsevne på antallet af åbne GJs19; Men, det teknisk krævende, tidskrævende og dyrt20. Jeg-YFP-GJIC-analysen blev udviklet til brug i HTS.
Figur 1 illustrerer de komponenter og trin af-YFP GJIC assay, der udnytter acceptor celler, der udtrykker en Iodid-følsomme YFP variant forsynet med H148Q og I152L (YFPQL) og donor celler, der udtrykker en Iodid transporter (SLC26A4)21 . De to mutationer af YFPQL tillade quenching af fluorescens af Iodid22. Jodider føjes til co kulturperler acceptor og donor celler; de indtaste ikke acceptor celler, men er taget af SLC26A4 transportører stede på donor celler. Jodider i cellerne, donor diffuse gennem velfungerende GJs i tilstødende acceptor celler hvor de slukke YFPQL fluorescens. Hvis GJs er lukket eller blokeret af hæmmere, angive Iodid ikke acceptor celler for at slukke fluorescens. YFPQL quenching sats afspejler GJ aktivitet. YFP GJIC analyseprocedure er hverken kompliceret eller tidskrævende. Det er foreneligt med HTS og kan bruges til at teste virkningerne af et stort antal forbindelser på GJ aktivitet i en relativt kort periode. Det kræver kun acceptor og donor celler og to afbalanceret saltopløsninger. Protokollen beskrevet nedenfor er baseret på LN215 celler hvis store Cx er Cx4321. LN215-YFPQL receptor og LN215-jeg− donor celler blev genereret af transduktion med lentiviruses udtrykker YFPQL eller SLC26A421,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Jeg-YFP-GJIC-analysen kan anvendes til HTS, fordi det er robust, hurtig og billig. En HTS analysen anses for robust hvis Z’-faktor er over 0,525. Se Zhang et al. for en beskrivelse af den statistiske analyse anvendes til vurderingen af egnetheden af HTS assays25. Når LN215 celler blev brugt, Z’-faktor var > 0,5 uden nogen assay optimering. Hvis andre celletyper er brugt i analysen og dens Z’-faktor er < 0.5, robusthed kan forbedres ved at udvide assay gang<sup class="xref"…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev støttet af den grundlæggende videnskab forskningsprogram gennem National Research Foundation af Korea (NRF) finansieret af Undervisningsministeriet (2011-0023701, 2016R1D1A1A02937397, og 2018R1A6A1A03023718).
Materials
| 96-well plate | SPL | 30096 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C5670 | I-solution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C-solution, I-solution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | sigma | 276855 | |
| HEPES | Sigma | RES6003H-B7 | C-solution, I-solution |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | transfection reagent |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2 6H2O) | Sigma | M2393 | C-solution |
| Microplate reader | BMG LabTech | POLARstar Omega 415-1618 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| Polybrene | sigma | H9268 | |
| Poly-L-lysine solution | sigma | P4707 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | C-solution, I-solution |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| Puromycin Dihydrochloride | sigma | P8833 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S5886 | C-solution, I-solution |
| Sodium hyroxide (NaOH) | Sigma | S2770 | |
| Sodium Iodide (NaI) | Sigma | 383112 | I-solution |
References
- Goodenough, D. a., Goliger, J. a., Paul, D. L. Connexins, connexons, and Intercellular Communication. Annual Review of Biochemistry. 65, 475-502 (1996).
- Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. Modulated Gap Junctional Intercellular Communication as a Biomarker of PAH Epigenetic Toxicity: Structure-Function Relationship. Environmental Health Perspectives. 106, 975 (1998).
- U, J. E. T., Chang, C., Upham, B., Wilson, M. Epigenetic toxicology as toxicant-induced changes in intracellular signalling leading to altered gap junctional intercellular communication. Toxicology Letters. , 71-78 (1998).
- Yamasaki, H. Role of disrupted gap junctional intercellular communications in detection and characterization of carcinogens. Mutation Research – Reviews in Genetic Toxicology. , (1996).
- Yamasaki, H., et al. Gap junctional intercellular communication and cell proliferation during rat liver carcinogenesis. Environmental Health Perspectives. 101, 191-197 (1993).
- Vinken, M., et al. Gap junctional intercellular communication as a target for liver toxicity and carcinogenicity. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 44, 201-222 (2009).
- Fonseca, C. G., Green, C. R., Nicholson, L. F. B. Upregulation in astrocytic connexin 43 gap junction levels may exacerbate generalized seizures in mesial temporal lobe epilepsy. Brain Research. 929 (1), 105-116 (2002).
- Garbelli, R., et al. Expression of connexin 43 in the human epileptic and drug-resistant cerebral cortex. Neurology. 76 (10), 895-902 (2011).
- Schulz, R., et al. Connexin 43 is an emerging therapeutic target in ischemia/reperfusion injury, cardioprotection and neuroprotection. Pharmacology and Therapeutics. 153, 90-106 (2015).
- Sarrouilhe, D., Dejean, C., Mesnil, M. Involvement of gap junction channels in the pathophysiology of migraine with aura. Frontiers in Physiology. , (2014).
- Patel, S. J., et al. Gap junction inhibition prevents drug-induced liver toxicity and fulminant hepatic failure. Nature Biotechnology. 30 (2), 179-183 (2012).
- Kandyba, E. E., Hodgins, M. B., Martin, P. E. A murine living skin equivalent amenable to live-cell imaging: analysis of the roles of connexins in the epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 128 (4), 1039-1049 (2008).
- Upham, B. L., et al. Differential roles of 2 , 6 , and 8 carbon ceramides on the modulation of gap junctional communication and apoptosis during carcinogenesis. Cancer Letters. 191, 27-34 (2003).
- Upham, B. L., et al. Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems. Environmental Health Perspectives. 117 (4), 545-551 (2009).
- Weis, L. M., et al. Bay or Baylike Regions of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Were Potent Inhibitors of Gap Intercellular Communication. Environmental Health Perspectives. 106 (1), 17-22 (1998).
- el-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-Loading and Dye Transfer: A Rapid and Simple Technique to Study Gap Junctional Intercellular Communication. Experimental Cell Research. 168 (2), 422-430 (1987).
- Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. Photobleaching Assay of Gap Junction- Mediated Communication Between Human Cells. Advancement of Science. 232 (4749), 525-528 (2010).
- Abbaci, M., et al. In vitro characterization of gap junctional intercellular communication by gap-FRAP technique. Proceedings of SPIE. , 585909 (2005).
- Neyton, J., Trautmann, A. Single-channel currents of an intercellular junction. Nature. 317 (6035), 331-335 (1985).
- Wilders, R., Jongsma, H. J. Limitations of the dual voltage clamp method in assaying conductance and kinetics of gap junction channels. Biophysical Journal. 63 (4), 942-953 (1992).
- Lee, J. Y., Choi, E. J., Lee, J. A new high-throughput screening-compatible gap junctional intercellular communication assay. BMC Biotechnology. 15 (1), 1-9 (2015).
- Galietta, L. J. V., Haggie, P. M., Verkman, A. S. Green fluorescent protein-based halide indicators with improved chloride and iodide affinities. FEBS Letters. 499 (3), 220-224 (2001).
- Lee, J. Y., Yoon, S. M., Choi, E. J., Lee, J. Terbinafine inhibits gap junctional intercellular communication. Toxicology and Applied Pharmacology. 307, 102-107 (2016).
- Hughes, J., Rees, S., Kalindjian, S., Philpott, K. Principles of early drug discovery. British Journal of Pharmacology. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Upham, B. L. Role of Integrative Signaling Through Gap Junctions in Toxicology. Current Protocols in Toxicology. , (2011).
- Schalper, K. A., et al. Modulation of gap junction channels and hemichannels by growth factors. Molecular BioSystems. 8 (3), 685-698 (2012).
- Kulkarni, G. V., Mcculloch, C. A. G. Serum deprivation induces apoptotic cell death in a subset of Balb / c 3T3 fibroblasts. Journal of Cell Science. 1179, 1169-1179 (1994).
- Harris, A. L., Locke, D. Permeability of Connexin Channels. Connexins. , 165-206 (2009).
- Choi, E. J., Yeo, J. H., Yoon, S. M., Lee, J. Gambogic Acid and Its Analogs Inhibit Gap. Junctional Intercellular Communication. 9, 1-10 (2018).
