Assay תקשורת צומת-המערכת יודיד-צהוב הניאון חלבון-Gap
Summary
כאן, אנו מציגים עבור הרומן הפער צומת תקשורת המערכת assay המיועד להקרנה תפוקה גבוהה של הפער להתכוונן צומת כימיקלים גילוי תרופות רעילות הערכת פרוטוקול.
Abstract
הפער צמתים (GJs) הם ערוצי קרום התא לאפשר דיפוזיה של מולקולות קטנות יותר מאשר 1 kDa בין תאים סמוכים. כפי שהם תפקידים פיזיולוגיים ופתולוגיים, יש צורך של תפוקה גבוהה ההקרנה (HTS) מבחני לזהות GJ מאפננים במבחני גילוי של הרעלים סמים. Assay המערכת-צומת תקשורת (I-YFP-GJIC) הרומן יודיד-צהוב הניאון חלבון-gap ממלא את הצורך הזה. זה וזמינותו מבוססת תא כולל תאים מקבל ושל התורמים מתוכננים לבטא stably משתנה צהוב חלבון פלואורסצנטי (YFP), זריחה של מי הוא ברגישות מתרצה יודיד, או SLC26A4, טרנספורטר יודיד, בהתאמה. כשנוספת יודיד לתרבות מעורב מסוגי תאים שני, הם להזין את תאי התורם באמצעות המשגר SLC26A4, טשטוש לתאים סמוכים מקבל דרך GJs איפה הם להרוות את פלורסצנטיות YFP. קרינה פלואורסצנטית YFP נמדד טוב מאת טוב במצב קינטי. הקצב quenching YFP משקף פעילות GJ. וזמינותו הוא אמין ומהיר מספיק כדי לשמש עבור HTS. הפרוטוקול עבור וזמינותו אני-YFP-GJIC באמצעות תאי LN215, תאים אנושיים glioma, מתואר.
Introduction
הפער צמתים (GJs) לשמש ערוצי המערכת לאפשר פעפוע של מולקולות קטנות של < kDa 1 כגון חומרים מזינים, מטבוליטים מולקולות איתות בין תאים סמוכים. האלמנטים מהחיבור כוללים hemichannel או connexon בכל תא, ומהווה כל connexon connexins (Cxs) 61. GJs ו Cxs שימשו מבחני הרעלים של חומרים מסרטנים כגון פחמימנים ארומטיים polycyclic (הפה), אשר GJ מעכבי2,3,4. GJIC שיבשו נמצא קשור nongenotoxic carcinogenesis5,6. טיפולית כמטרה פוטנציאליים, מעורבות GJ דווחה ב תתי סוגים מסוימים של7,התקפים8, הגנה מפני הלב והמוח איסכמיה/פגיעה reperfusion פציעה9, מיגרנה עם אאורה10, שיכרון פגיעה בכבד6,11,12ריפוי הפצע. תפוקה גבוהה ההקרנה (HTS) מבחני נדרשים כדי לזהות להתכוונן GJ כימיקלים או נוגדנים לגילוי סמים, עבור מבחני רעלים, וכדי לזהות הרגולטורים הסלולר הרומן של פעילות GJ. מבחני HTS יכול לשמש גם כדי לחקור מבנה-פעילות הגומלין של GJ מאפננים2,13,14,15.
כמה מבחני GJIC כוללים העברת צבע או טכניקות מלחציים תיקון כפול. לוציפר צהוב CH (LY) ו- calcein acetoxymethyl אסתר (calcein-AM) שימשו מבחני העברת צבע. התאים אינם חדיר כדי LY, אשר הציג microinjection, מגרדים טעינה או אלקטרופורציה. פעם אחת בתוך התא, LY מתפשט לתוך השכנה תאים באמצעות GJs, פעילות GJ הוא לבדיקה על פי מידת ה-הגירה LY16. מבחני Calcein-אם כרוכים בדרך כלל הפער-זריחה התאוששות לאחר17,photobleaching18. Calcein-אם הוא צבע התא-permeant זה מומר intracellularly calcein אטום על ידי esterase מהותי. וזמינותו מחייבת מיקרוסקופ קונפוקלי להתבונן בהעברת calcein-אם בתוך תא מן הסובבים אותו בעקבות לייזר photobleaching. אם GJs פונקציונלי קיימות, calcein-אם תאים סמוכים מזין את התאים photobleached, ידי קרינה פלואורסצנטית הוא התאושש. פעילות GJ הוא לבדיקה על פי מידת פלורסצנטיות שחזור של תאי photobleached. צבע-העברת מבחני מפרך וצורכת זמן או בעלי רגישויות נמוכה. תיקון כפול מחבר חובק למעקה היא שיטת אלקטרופיזיולוגיות המודד מוליכות מהחיבור. . זה רגיש יחסית, עם תלות ישירה של מוליכות על מספר GJs פתוח19; עם זאת, כל דבר טכנית אחר, זמן רב ויקר20 הבדיקה אני-YFP-GJIC פותחה לשימוש ב- HTS.
איור 1 מדגימה את הרכיבים ואת השלבים של GJIC-YFP וזמינותו, אשר מנצל תאים מקבל ביטוי variant YFP רגיש יודיד הנושאת H148Q ו- I152L (YFPקי) ותאים התורם לבטא של טרנספורטר יודיד (SLC26A4)21 . שתי מוטציות שישאו YFPקי לאפשר שכבתה של קרינה פלואורסצנטית מאת יודיד22. Iodides מתווספים מקבל תרבותי משותף ותאים התורם; הם לא תזין את התאים מקבל, אבל שנלקחה על ידי למעליות SLC26A4 נוכח בתאי התורם. Iodides בתאי התורם מפוזרת באמצעות GJs מתפקדת לתאים סמוכים מקבל שבו הם להרוות את פלורסצנטיות YFPקי . אם GJs סגורים או נחסם על-ידי מעכבי, יודיד אין באפשרותך להזין את התאים מקבל כדי להרוות את קרינה פלואורסצנטית. הקצב quenching YFPקי משקף פעילות GJ. הנוהל וזמינותו של GJIC-YFP הוא לא מסובך ולא זמן רב. זה תואם HTS והוא יכול לשמש כדי לבדוק את ההשפעות של מספר רב של תרכובות בפעילות GJ בתקופה קצרה יחסית. זה דורש רק מקבל תאי התורם ואת שני פתרונות מלח מאוזנת. הפרוטוקול המתואר להלן מבוססת על תאים LN215 Cx העיקרי שלו הוא Cx4321. הקולטן LN215-YFPקי ואת LN215-אני תאי התורם− היו שנוצר על ידי התמרה חושית עם lentiviruses לבטא YFPקי או SLC26A421,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
הבדיקה אני-YFP-GJIC יכול לשמש עבור HTS כי זה חזקה, מהירה וזולה. Assay HTS נחשבת חזקה אם ז ‘-פקטור הוא מעל 0.525. מבחני לראות ג’אנג et al. לתיאור של ניתוח סטטיסטי המשמש כדי לבדוק את התאמת HTS25. כאשר תאים LN215 שימשו, ז ‘-גורם היה > 0.5 ללא כל אופטימיזציה וזמינותו. אם סוגי תאים אחרים משמשים וז?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על-ידי התוכנית מחקר מדעי בסיסי דרך לאומי מחקר קרן של קוריאה (ב- NRF) ממומן על ידי משרד החינוך (2011-0023701, 2016R1D1A1A02937397, ו 2018R1A6A1A03023718).
Materials
| 96-well plate | SPL | 30096 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C5670 | I-solution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C-solution, I-solution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | sigma | 276855 | |
| HEPES | Sigma | RES6003H-B7 | C-solution, I-solution |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | transfection reagent |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2 6H2O) | Sigma | M2393 | C-solution |
| Microplate reader | BMG LabTech | POLARstar Omega 415-1618 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| Polybrene | sigma | H9268 | |
| Poly-L-lysine solution | sigma | P4707 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | C-solution, I-solution |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| Puromycin Dihydrochloride | sigma | P8833 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S5886 | C-solution, I-solution |
| Sodium hyroxide (NaOH) | Sigma | S2770 | |
| Sodium Iodide (NaI) | Sigma | 383112 | I-solution |
References
- Goodenough, D. a., Goliger, J. a., Paul, D. L. Connexins, connexons, and Intercellular Communication. Annual Review of Biochemistry. 65, 475-502 (1996).
- Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. Modulated Gap Junctional Intercellular Communication as a Biomarker of PAH Epigenetic Toxicity: Structure-Function Relationship. Environmental Health Perspectives. 106, 975 (1998).
- U, J. E. T., Chang, C., Upham, B., Wilson, M. Epigenetic toxicology as toxicant-induced changes in intracellular signalling leading to altered gap junctional intercellular communication. Toxicology Letters. , 71-78 (1998).
- Yamasaki, H. Role of disrupted gap junctional intercellular communications in detection and characterization of carcinogens. Mutation Research – Reviews in Genetic Toxicology. , (1996).
- Yamasaki, H., et al. Gap junctional intercellular communication and cell proliferation during rat liver carcinogenesis. Environmental Health Perspectives. 101, 191-197 (1993).
- Vinken, M., et al. Gap junctional intercellular communication as a target for liver toxicity and carcinogenicity. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 44, 201-222 (2009).
- Fonseca, C. G., Green, C. R., Nicholson, L. F. B. Upregulation in astrocytic connexin 43 gap junction levels may exacerbate generalized seizures in mesial temporal lobe epilepsy. Brain Research. 929 (1), 105-116 (2002).
- Garbelli, R., et al. Expression of connexin 43 in the human epileptic and drug-resistant cerebral cortex. Neurology. 76 (10), 895-902 (2011).
- Schulz, R., et al. Connexin 43 is an emerging therapeutic target in ischemia/reperfusion injury, cardioprotection and neuroprotection. Pharmacology and Therapeutics. 153, 90-106 (2015).
- Sarrouilhe, D., Dejean, C., Mesnil, M. Involvement of gap junction channels in the pathophysiology of migraine with aura. Frontiers in Physiology. , (2014).
- Patel, S. J., et al. Gap junction inhibition prevents drug-induced liver toxicity and fulminant hepatic failure. Nature Biotechnology. 30 (2), 179-183 (2012).
- Kandyba, E. E., Hodgins, M. B., Martin, P. E. A murine living skin equivalent amenable to live-cell imaging: analysis of the roles of connexins in the epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 128 (4), 1039-1049 (2008).
- Upham, B. L., et al. Differential roles of 2 , 6 , and 8 carbon ceramides on the modulation of gap junctional communication and apoptosis during carcinogenesis. Cancer Letters. 191, 27-34 (2003).
- Upham, B. L., et al. Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems. Environmental Health Perspectives. 117 (4), 545-551 (2009).
- Weis, L. M., et al. Bay or Baylike Regions of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Were Potent Inhibitors of Gap Intercellular Communication. Environmental Health Perspectives. 106 (1), 17-22 (1998).
- el-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-Loading and Dye Transfer: A Rapid and Simple Technique to Study Gap Junctional Intercellular Communication. Experimental Cell Research. 168 (2), 422-430 (1987).
- Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. Photobleaching Assay of Gap Junction- Mediated Communication Between Human Cells. Advancement of Science. 232 (4749), 525-528 (2010).
- Abbaci, M., et al. In vitro characterization of gap junctional intercellular communication by gap-FRAP technique. Proceedings of SPIE. , 585909 (2005).
- Neyton, J., Trautmann, A. Single-channel currents of an intercellular junction. Nature. 317 (6035), 331-335 (1985).
- Wilders, R., Jongsma, H. J. Limitations of the dual voltage clamp method in assaying conductance and kinetics of gap junction channels. Biophysical Journal. 63 (4), 942-953 (1992).
- Lee, J. Y., Choi, E. J., Lee, J. A new high-throughput screening-compatible gap junctional intercellular communication assay. BMC Biotechnology. 15 (1), 1-9 (2015).
- Galietta, L. J. V., Haggie, P. M., Verkman, A. S. Green fluorescent protein-based halide indicators with improved chloride and iodide affinities. FEBS Letters. 499 (3), 220-224 (2001).
- Lee, J. Y., Yoon, S. M., Choi, E. J., Lee, J. Terbinafine inhibits gap junctional intercellular communication. Toxicology and Applied Pharmacology. 307, 102-107 (2016).
- Hughes, J., Rees, S., Kalindjian, S., Philpott, K. Principles of early drug discovery. British Journal of Pharmacology. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Upham, B. L. Role of Integrative Signaling Through Gap Junctions in Toxicology. Current Protocols in Toxicology. , (2011).
- Schalper, K. A., et al. Modulation of gap junction channels and hemichannels by growth factors. Molecular BioSystems. 8 (3), 685-698 (2012).
- Kulkarni, G. V., Mcculloch, C. A. G. Serum deprivation induces apoptotic cell death in a subset of Balb / c 3T3 fibroblasts. Journal of Cell Science. 1179, 1169-1179 (1994).
- Harris, A. L., Locke, D. Permeability of Connexin Channels. Connexins. , 165-206 (2009).
- Choi, E. J., Yeo, J. H., Yoon, S. M., Lee, J. Gambogic Acid and Its Analogs Inhibit Gap. Junctional Intercellular Communication. 9, 1-10 (2018).
