An आयोडाइड-पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन गैप जंक्शन-सेलुलर संचार परख
Summary
यहां, हम अंतर जंक्शन के उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के लिए डिजाइन एक उपंयास अंतर जंक्शन सेलुलर संचार परख के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद-दवा की खोज और विषाक्तता आकलन के लिए रसायन संग्राहक ।
Abstract
गैप जंक्शनों (GJs) सेल झिल्ली चैनल है कि छोटे अणुओं के प्रसार की अनुमति से सटे कोशिकाओं के बीच 1 केडीए हैं । के रूप में वे शारीरिक और रोग भूमिकाओं है, वहां उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग (HTS) परख की जरूरत है दवा खोज और विषविज्ञान परख में GJ मॉडुलन की पहचान है । एक उपंयास आयोडाइड-पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन गैप जंक्शन-सेलुलर संचार (मैं YFP-GJIC) परख इस जरूरत को पूरा । यह एक सेल स्वीकारकर्ता और दाता कोशिकाओं है कि छुरा एक पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) संस्करण, जिसका प्रतिदीप्ति संवेदनशील आयोडाइड, या SLC26A4, एक आयोडाइड ट्रांसपोर्टर, क्रमशः द्वारा बुझती है व्यक्त इंजीनियर है सहित परख आधारित है । जब आयोडाइड दो सेल प्रकार के एक मिश्रित संस्कृति में जोड़ा जाता है, वे SLC26A4 ट्रांसपोर्टर के माध्यम दाता कोशिकाओं में प्रवेश और GJs के माध्यम से आसंन स्वीकारकर्ता कोशिकाओं को फैलाना जहां वे YFP प्रतिदीप्ति बुझाने । YFP प्रतिदीप्ति अच्छी तरह से एक काइनेटिक मोड में मापा जाता है । YFP शमन दर GJ गतिविधि को दर्शाता है । परख विश्वसनीय और काफी तेजी से HTS के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है । मैं-YFP-GJIC परख LN215 कोशिकाओं, मानव तंत्रिकाबंधार्बुद कोशिकाओं का उपयोग कर के लिए प्रोटोकॉल, वर्णित है ।
Introduction
गैप जंक्शनों (GJs) में सेलुलर चैनल के रूप में कार्य करने के लिए < 1 केडीए के छोटे अणुओं जैसे पोषक तत्वों, चयापचयों के प्रसार की अनुमति है, और आसंन कोशिकाओं के बीच अणुओं संकेत । जंक्शनीय तत्वों में प्रत्येक कोशिका में एक hemichannel या connexon शामिल है, और प्रत्येक connexon का गठन छह connexins (Cxs)1. GJs और Cxs जैसे एरोमेटिक खुशबूदार हाइड्रोकार्बन (पः), जो GJ अवरोधकों2,3,4है के रूप में कैंसर की विषविज्ञान परख में इस्तेमाल किया गया है । बाधित GJIC nongenotoxic कैंसरजनन5,6के साथ संबद्ध किया गया है । एक संभावित चिकित्सकीय लक्ष्य के रूप में, GJ शामिल बरामदगी के विशेष उपप्रकार में सूचित किया गया है7,8, हृदय और मस्तिष्क के ischemia से संरक्षण/reperfusion चोट9, आभा10के साथ माइग्रेन, दवा प्रेरित जिगर की चोट6,11, और घाव भरने12. उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग (HTS) परख GJ की पहचान करने के लिए आवश्यक है-संग्राहक रसायन या दवा की खोज के लिए एंटीबॉडी, विषविज्ञान परख के लिए, और GJ गतिविधि के उपंयास सेलुलर नियामकों की पहचान । HTS परख भी GJ ढा2,13,14,15के संरचना-गतिविधि संबंधों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
कुछ GJIC परख डाई स्थानांतरण या दोहरी पैच दबाना तकनीक शामिल हैं । लूसिफ़ेर पीला CH () और calcein acetoxymethyl एस्टर (calcein-AM) डाई-स्थानांतरण परख में इस्तेमाल किया गया है । कोशिकाओं को पारगंय नहीं कर रहे हैं, जो microinjection द्वारा शुरू की है, scraping लोड हो रहा है, या electroporation । एक बार कोशिका के अंदर, GJs और GJ गतिविधि के माध्यम से पड़ोसी कोशिकाओं में फैल जाता है, जो कि16स्थानांतरण की हद तक परख कर लिया जाता है । Calcein-हूं परख आमतौर पर शामिल गैप-प्रतिदीप्ति वसूली के बाद17photobleaching,18। Calcein-AM एक सेल permeant डाई कि एक आंतरिक Calcein द्वारा अभेद्य esterase में intracellularly में परिवर्तित कर दिया है । परख एक फोकल माइक्रोस्कोप की आवश्यकता के लिए calcein के हस्तांतरण का पालन-यह लेजर photobleaching निंनलिखित आसपास के लोगों से एक सेल में हूं । यदि कार्यशील GJs मौजूद हैं, तो सन्निकट कक्षों में calcein-AM photobleached कक्षों में प्रवेश करता है और प्रतिदीप्ति पुनर्प्राप्त किया जाता है. GJ गतिविधि photobleached कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति वसूली की हद तक परख है । डाई हस्तांतरण परख श्रमसाध्य और समय लेने या कम संवेदनशीलता है । दोहरी पैच clamping एक electrophysiological विधि है कि उपाय जंक्शन के कंडक्टर है । यह खुला GJs19की संख्या पर कंडक्टर की सीधी निर्भरता के साथ अपेक्षाकृत संवेदनशील है; हालांकि, यह तकनीकी रूप से मांग, समय लगता है, और20महंगी है । मैं-YFP-GJIC परख HTS में इस्तेमाल के लिए विकसित किया गया था ।
चित्रा 1 घटकों और मैं-YFP GJIC परख, जो स्वीकार करता है एक आयोडाइड-संवेदनशील YFP संस्करण असर H148Q और I152L (YFPQL) और दाता कोशिकाओं एक आयोडाइड ट्रांसपोर्टर (SLC26A4) एक्सप्रेस 21 व्यक्त कोशिकाओं का इस्तेमाल के कदम दिखाता है . दो YFPQL द्वारा किए गए उत्परिवर्तनों22आयोडाइड द्वारा प्रतिदीप्ति की शमन अनुमति देते हैं । Iodides को सह-कल्चरल स्वीकारकर्ता और दाता कोशिकाओं में जोड़ा जाता है; वे स्वीकारकर्ता कोशिकाओं में प्रवेश नहीं करते हैं, लेकिन दाता की कोशिकाओं पर मौजूद SLC26A4 ट्रांसपोर्टरों द्वारा उठाए जाते हैं । दाता कोशिकाओं में Iodides आसंन स्वीकार करने वाले कोशिकाओं में GJs कामकाज के माध्यम से फैलाना जहां वे YFPQL प्रतिदीप्ति बुझाने । GJs बंद या अवरोधकों द्वारा अवरुद्ध कर रहे हैं, तो आयोडाइड प्रतिदीप्ति बुझाने के लिए स्वीकारकर्ता कोशिकाओं में प्रवेश नहीं कर सकते । YFPQL शमन दर GJ गतिविधि को दर्शाता है । मैं-YFP GJIC परख प्रक्रिया न तो जटिल है और न ही समय लगता है । यह HTS के साथ संगत है और एक अपेक्षाकृत कम अवधि में GJ गतिविधि पर यौगिकों की एक बड़ी संख्या के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह केवल स्वीकारकर्ता और दाता कोशिकाओं की आवश्यकता है, और दो संतुलित नमक समाधान । नीचे वर्णित प्रोटोकॉल LN215 कोशिकाओं पर आधारित है जिसका प्रमुख Cx21Cx43 है । LN215-YFPQL रिसेप्टर और LN215-I− दाता कोशिकाएं transduction के lentiviruses YFP या QL 21,23को व्यक्त करने के साथ उत्पन्न हुई थीं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
मैं-YFP-GJIC परख HTS के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है क्योंकि यह मजबूत है, तेजी से, और सस्ती । एक HTS परख मजबूत माना जाता है अगर Z’-फैक्टर ०.५25से ऊपर है । झांग एट अल मिलते हैं । HTS परख25की उपयुक्तता का आकल…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को बेसिक साइंस रिसर्च प्रोग्राम द्वारा नेशनल रिसर्च फाउंडेशन ऑफ कोरिया (एनआरएफ) द्वारा वित्त पोषित शिक्षा मंत्रालय (2011-0023701, 2016R1D1A1A02937397, और 2018R1A6A1A03023718) के जरिए सपोर्ट किया गया ।
Materials
| 96-well plate | SPL | 30096 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C5670 | I-solution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C-solution, I-solution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | sigma | 276855 | |
| HEPES | Sigma | RES6003H-B7 | C-solution, I-solution |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | transfection reagent |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2 6H2O) | Sigma | M2393 | C-solution |
| Microplate reader | BMG LabTech | POLARstar Omega 415-1618 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| Polybrene | sigma | H9268 | |
| Poly-L-lysine solution | sigma | P4707 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | C-solution, I-solution |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| Puromycin Dihydrochloride | sigma | P8833 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S5886 | C-solution, I-solution |
| Sodium hyroxide (NaOH) | Sigma | S2770 | |
| Sodium Iodide (NaI) | Sigma | 383112 | I-solution |
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