Ett jodid-gul fluorescerande Protein-Gap Junction-kommunikationen test
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för en roman gap junction kommunikationen analysen avsedd för high-throughput screening av gap junction-modulerande kemikalier för läkemedelsutveckling och toxikologisk bedömning.
Abstract
Gap-junctions (GJs) är cellmembranet kanaler som tillåter diffusionshastighet för molekyler som är mindre än 1 kDa mellan angränsande celler. Som de har fysiologiska och patologiska roller, finns det behov av high-throughput screening (HTS) analyser för att identifiera GJ modulatorer i drug discovery och toxikologiska analyser. En roman jodid-gul fluorescerande protein-gap junction-kommunikationen (I-YFP-GJIC)-analysen uppfyller detta behov. Det är en cell-baserad analys inklusive acceptor och givare celler som är konstruerade för att stabilt express en gul fluorescerande protein (YFP) variant, vars fluorescens är känsligt släckas av jodid, eller SLC26A4, en jodid transportören, respektive. När jodid tillsätts en blandad kultur av de två celltyper, de ange donatorcellerna via SLC26A4 transportören och diffusa till intilliggande acceptor celler via GJs där de släcka YFP fluorescensen. YFP fluorescens mäts väl av brunn i en kinetic läge. YFP släcka priset återspeglar GJ aktivitet. Analysen är tillförlitlig och snabb nog att användas för HTS. Protokollet för jag-YFP-GJIC analysen använder LN215 cellerna, mänskliga glioma celler, beskrivs.
Introduction
Gap-junctions (GJs) fungerar som intercellulära kanaler tillåta spridningen av små molekyler av < 1 kDa som näringsämnen, metaboliter och signalmolekyler mellan angränsande celler. Junktional element inkluderar en hemichannel eller connexon i varje cell och varje connexon utgör sex connexins (Cxs)1. GJs och Cxs har använts i toxikologiska analyser av cancerframkallande ämnen som polycykliska aromatiska kolväten (PAH), som är GJ-hämmare2,3,4. Störd GJIC har associerats med nongenotoxic carcinogenes5,6. Som potentiella terapeutiska mål, har GJ engagemang rapporterats i vissa subtyper av anfall7,8, skydd från hjärt och hjärna ischemi/reperfusion skada9, migrän med aura10, läkemedelsinducerad leverskada6,11och12för sårläkning. High-throughput screening (HTS) analyser krävs att identifiera GJ-modulerande kemikalier eller antikroppar för läkemedelsutveckling, för toxikologiska analyser, och identifiera nya cellulära regulatorer av GJ aktivitet. HTS-analyser kan också användas för att undersöka struktur-aktivitetssamband GJ modulatorer2,13,14,15.
Vissa GJIC analyser innehåller färgämne överföring eller dual patch clamp tekniker. Lucifer gul CH (LY) och calcein acetoximetyl ester (calcein-AM) har använts i dye-överföring analyser. Celler är inte genomsläppliga för LY, som introduceras av Mikroskop, skrapa lastning eller elektroporation. En gång inne i cellen, LY sprider sig till närliggande celler via GJs och GJ aktivitet har analyserats av omfattningen av de LY migration16. Calcein-AM analyser innebära brukar gap-fluorescens återhämtning efter fotoblekning17,18. Calcein-AM är ett cell-diffusionskoefficient färgämne som konverteras intracellulärt till ogenomtränglig calcein genom en inneboende esteras. Analysen kräver en confocal Mikroskop för att iaktta överföringen av calcein-AM i en cell från de omgivande efter laser fotoblekning. Om det finns funktionella GJs calcein-AM i intilliggande celler träder photobleached cellerna och fluorescensen återvinns. GJ aktivitet har analyserats av omfattningen av fluorescens återhämtning av photobleached celler. Dye-överföring analyser är mödosam och tidskrävande eller har låg känslighet. Dubbla patch fastspänning är en Elektrofysiologisk metod som mäter Junktional konduktans. Det är relativt känslig, med ett direkt beroende av konduktans antalet öppna GJs19; emellertid, det är tekniskt krävande, tidskrävande och dyra20. Jag-YFP-GJIC analysen har utvecklats för användning i HTS.
Figur 1 illustrerar komponenter och steg i jag-YFP GJIC analysen, som utnyttjar acceptor celler som uttrycker en jodid-känsliga YFP variant försedd med H148Q och I152L (YFPQL) och givare celler som uttrycker en jodid transportör (SLC26A4)21 . De två mutationer som bärs av YFPQL tillåta snabbkylning av fluorescens av jodid22. Jodider läggs och till co odlade acceptor donatorcellerna; de anger inte acceptor cellerna, men tas upp av SLC26A4 transportörerna närvarande på donatorcellerna. Jodider i donatorcellerna diffunderar genom fungerande GJs i intilliggande acceptor celler där de släcka YFPQL fluorescensen. Om GJs är stängda eller blockeras av hämmare, ange jodid inte acceptor cellerna för att släcka fluorescensen. YFPQL släcka priset återspeglar GJ aktivitet. Jag-YFP GJIC analysförfarandet är varken tidskrävande som komplicerade. Den är kompatibel med HTS och kan användas för att testa effekterna av ett stort antal föreningar på GJ aktivitet i en relativt kort period. Det kräver endast acceptor och givare celler och två balanserade salt lösningar. Protokollet beskrivs nedan bygger på LN215 celler vars stora Cx är Cx4321. Den LN215-YFPQL -receptorn och LN215-jag− donatorcellerna genererades av transduktion med lentiviruses uttrycker YFPQL eller SLC26A421,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Jag-YFP-GJIC analysen kan användas för HTS eftersom det är robust, snabb och billig. En HTS analysmetod anses robust om Z’-faktor är över 0,525. Se Zhang et al. en beskrivning av den statistiska analysen används för att bedöma lämpligheten hos HTS analyser25. När LN215 celler användes, Z’-faktorn var > 0,5 utan någon assay optimering. Om andra celltyper som används i analysen och dess Z’-faktorn är < 0.5, robustheten kan förbättras genom att utvidga den assa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av den grundläggande vetenskap forskningsprogrammet genom den nationella Research Foundation i Korea (NRF) finansieras av undervisningsministeriet (2011-0023701, 2016R1D1A1A02937397, och 2018R1A6A1A03023718).
Materials
| 96-well plate | SPL | 30096 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C5670 | I-solution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C-solution, I-solution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | sigma | 276855 | |
| HEPES | Sigma | RES6003H-B7 | C-solution, I-solution |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | transfection reagent |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2 6H2O) | Sigma | M2393 | C-solution |
| Microplate reader | BMG LabTech | POLARstar Omega 415-1618 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| Polybrene | sigma | H9268 | |
| Poly-L-lysine solution | sigma | P4707 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | C-solution, I-solution |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| Puromycin Dihydrochloride | sigma | P8833 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S5886 | C-solution, I-solution |
| Sodium hyroxide (NaOH) | Sigma | S2770 | |
| Sodium Iodide (NaI) | Sigma | 383112 | I-solution |
References
- Goodenough, D. a., Goliger, J. a., Paul, D. L. Connexins, connexons, and Intercellular Communication. Annual Review of Biochemistry. 65, 475-502 (1996).
- Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. Modulated Gap Junctional Intercellular Communication as a Biomarker of PAH Epigenetic Toxicity: Structure-Function Relationship. Environmental Health Perspectives. 106, 975 (1998).
- U, J. E. T., Chang, C., Upham, B., Wilson, M. Epigenetic toxicology as toxicant-induced changes in intracellular signalling leading to altered gap junctional intercellular communication. Toxicology Letters. , 71-78 (1998).
- Yamasaki, H. Role of disrupted gap junctional intercellular communications in detection and characterization of carcinogens. Mutation Research – Reviews in Genetic Toxicology. , (1996).
- Yamasaki, H., et al. Gap junctional intercellular communication and cell proliferation during rat liver carcinogenesis. Environmental Health Perspectives. 101, 191-197 (1993).
- Vinken, M., et al. Gap junctional intercellular communication as a target for liver toxicity and carcinogenicity. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 44, 201-222 (2009).
- Fonseca, C. G., Green, C. R., Nicholson, L. F. B. Upregulation in astrocytic connexin 43 gap junction levels may exacerbate generalized seizures in mesial temporal lobe epilepsy. Brain Research. 929 (1), 105-116 (2002).
- Garbelli, R., et al. Expression of connexin 43 in the human epileptic and drug-resistant cerebral cortex. Neurology. 76 (10), 895-902 (2011).
- Schulz, R., et al. Connexin 43 is an emerging therapeutic target in ischemia/reperfusion injury, cardioprotection and neuroprotection. Pharmacology and Therapeutics. 153, 90-106 (2015).
- Sarrouilhe, D., Dejean, C., Mesnil, M. Involvement of gap junction channels in the pathophysiology of migraine with aura. Frontiers in Physiology. , (2014).
- Patel, S. J., et al. Gap junction inhibition prevents drug-induced liver toxicity and fulminant hepatic failure. Nature Biotechnology. 30 (2), 179-183 (2012).
- Kandyba, E. E., Hodgins, M. B., Martin, P. E. A murine living skin equivalent amenable to live-cell imaging: analysis of the roles of connexins in the epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 128 (4), 1039-1049 (2008).
- Upham, B. L., et al. Differential roles of 2 , 6 , and 8 carbon ceramides on the modulation of gap junctional communication and apoptosis during carcinogenesis. Cancer Letters. 191, 27-34 (2003).
- Upham, B. L., et al. Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems. Environmental Health Perspectives. 117 (4), 545-551 (2009).
- Weis, L. M., et al. Bay or Baylike Regions of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Were Potent Inhibitors of Gap Intercellular Communication. Environmental Health Perspectives. 106 (1), 17-22 (1998).
- el-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-Loading and Dye Transfer: A Rapid and Simple Technique to Study Gap Junctional Intercellular Communication. Experimental Cell Research. 168 (2), 422-430 (1987).
- Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. Photobleaching Assay of Gap Junction- Mediated Communication Between Human Cells. Advancement of Science. 232 (4749), 525-528 (2010).
- Abbaci, M., et al. In vitro characterization of gap junctional intercellular communication by gap-FRAP technique. Proceedings of SPIE. , 585909 (2005).
- Neyton, J., Trautmann, A. Single-channel currents of an intercellular junction. Nature. 317 (6035), 331-335 (1985).
- Wilders, R., Jongsma, H. J. Limitations of the dual voltage clamp method in assaying conductance and kinetics of gap junction channels. Biophysical Journal. 63 (4), 942-953 (1992).
- Lee, J. Y., Choi, E. J., Lee, J. A new high-throughput screening-compatible gap junctional intercellular communication assay. BMC Biotechnology. 15 (1), 1-9 (2015).
- Galietta, L. J. V., Haggie, P. M., Verkman, A. S. Green fluorescent protein-based halide indicators with improved chloride and iodide affinities. FEBS Letters. 499 (3), 220-224 (2001).
- Lee, J. Y., Yoon, S. M., Choi, E. J., Lee, J. Terbinafine inhibits gap junctional intercellular communication. Toxicology and Applied Pharmacology. 307, 102-107 (2016).
- Hughes, J., Rees, S., Kalindjian, S., Philpott, K. Principles of early drug discovery. British Journal of Pharmacology. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Upham, B. L. Role of Integrative Signaling Through Gap Junctions in Toxicology. Current Protocols in Toxicology. , (2011).
- Schalper, K. A., et al. Modulation of gap junction channels and hemichannels by growth factors. Molecular BioSystems. 8 (3), 685-698 (2012).
- Kulkarni, G. V., Mcculloch, C. A. G. Serum deprivation induces apoptotic cell death in a subset of Balb / c 3T3 fibroblasts. Journal of Cell Science. 1179, 1169-1179 (1994).
- Harris, A. L., Locke, D. Permeability of Connexin Channels. Connexins. , 165-206 (2009).
- Choi, E. J., Yeo, J. H., Yoon, S. M., Lee, J. Gambogic Acid and Its Analogs Inhibit Gap. Junctional Intercellular Communication. 9, 1-10 (2018).
