심장 세포 치료를 위한 줄기 세포 DNA 무결성을 평가

요약

여기, 우리 세포 이식 전에 줄기 세포에서 DNA 무결성의 평가의 분석 실험 설정에 대 한 자세한 설명을 제공합니다.

초록

줄기 줄기 세포 유래 세포는 다양 한 퇴행 성 질환 재생 치료로 서 엄청난 잠재력이 있다. DNA는 줄기 세포를 포함 하 여 모든 셀에서 유전 정보의 창 고입니다 그리고 그것의 무결성은 재생 능력에 기본적 이다. 줄기 세포가 식 위한 필요한 수를 달성 하기 위해 실험실에서 급속 한 전파를 받 다. 빠른된 세포 성장 반응 산소, 생성, 에이전트 alkylating 등 축적 된 대사 산물에 의해 DNA 무결성의 손실에 지도 한다. 이 세포를 이식 가난한 engraftment 및 악화 장기의 재생 발생할 것 이다. 또한, 돌연변이, DNA 불안정, 세포 노화, DNA 손상 세포 리드를 이식 하 고 가능 하 게, 생명이 암 같은 질병. 따라서,이 식 위한 세포의 적합성을 평가 하는 품질 관리 방법에 대 한 즉각적인 필요가 있다. 여기, 우리는 이전에 세포 이식 줄기 세포의 DNA 무결성의 평가 대 한 단계별 프로토콜을 제공합니다.

서론

실험 및 임상 증거 세포 이식 적당히 마음^{1,2,,34,5 실패의 좌 심 실 수축 성능을 향상 시킬 수 보여줍니다. ,6,7,,89}. 최근 진보 심혈 관 재생;에 대 한 기회를 더 매력적인 연 이러한 체세포 pluripotency 유도 다른 심장 계보, 중요 한 것은 cardiomyocyte (CM)^10, 으로이 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)를 구분 하기에 재활 요인의 강제 식 포함 ^{11 , 12 , 13}. 인위적으로 생성 된....

프로토콜

1. 혜성 분석 결과

1. 시 약 준비
   1. 낮은 용 해 점 agarose 낮은 녹는 agarose의 500 mg 100 ml의 DNA-장소/물 RNA-무료. agarose를 녹이 고 때까지 전자 레인지에서 병을 열. 37 ° C 물 목욕까지 필요에 병을 배치 합니다.
      참고: 추가 읽기를 위해 Azqueta 그 외 여러분, DNA 해제 시간 및 여러 전기 요소²³agarose 농도의 영향을 공부한 참조.
   2. 재고 염료 솔루션 작업 x 1를 1:10,000 비에 트리 스-EDTA (테) 버퍼에 SYBR 녹색 DNA 염료 희석. 이 염료는 빛에 민감한, 그래서 어두운 장소에 보관.
   3. 세포 세포의 용 해 버퍼에 대 한 분해 세포의 용 해 버퍼의 100 mL (2.5 M NaCl, 0.1 m M EDTA, 10 mM Tris, 1% 트라이 톤 X-100) 이온을 제거 된 물 (디 H₂O). 그런 다음, 추가 10 M NaOH pH 10.0 조정. 4 ° c.에 버퍼를 냉각
   4. 알칼리 성 DNA-해제/전기 실행 버퍼에 대 한 해산 디 H₂o. 쿨 4 ° c 버퍼에에서 알칼리 성 ....

결과

인간 유도 만능 줄기 세포를 배양 하 고 DNA 무결성의 측정으로 사용 되었다, DNA 손상 및 꼬리 순간 혜성 분석 결과 의해 분석 되었다. iPS 세포는 낮은 녹는 점 agarose에 포함 되었고 유리 슬라이드에 배치. 셀, 다음, 세포의 용 해 버퍼, 이어서 supercoiled DNA를 알칼리 성 해결책으로 취급 됩니다. Nucleoids electrophoresed 했다 고 혜성 DNA 염료 (그림 1A-D)에 의해 시각화 했다. 혜성, 혜성 분석 결과 플러그인 (그림 2A-C)를 사용 하 여 ImageJ로 분석 되었다.

인간 iPS 세포 Doxo DNA 손상을 유도 하 고 긍정적인 컨트롤.......

토론

DNA 무결성을 셀 무결성을 그렸다. 손상된 DNA와 세포 스트레스에 자주 하 고 결국 그들의 완전성을 잃고. 줄기와 줄기 세포 유래 세포 이식 목적으로 전파 되 고 되는 그들의 원하는 기능을 수행 하는 셀에 대 한 주은. 손상된 DNA와 세포 이식 셀^8,20의 성능과 가난한 engraftment 속도 발생할 것 이다. 따라서, 세포 이식 전에 DNA 무결성 검사는 필요한 품질 관리 프로토콜입니다. 여기 우리 두 비용 효과적인 접근 방식, 즉는 혜성 분석 결과 및 γH2A.X 면역 형광 라벨, DNA 손상 및 줄기와 줄기 세포 유래 세포의 품질 평가를 설명 합니다.

세포 노화의 주요 원인 세포에서 DNA 손상의 축적 생각. 혜성 분석 결과 사용 하 여, 알 베이커 그 외 여러분 분석²²젊고 노화 인간 피부 섬유 아 세포 DNA 손상........

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.25% 트립신	코닝	25200056
8웰 챔버 슬라이드	밀리셀	PEZGS0816
Accutase	Stemcell Technologies	7920	세포 분리 솔루션
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson Immuno Research Laboratories	711-545-152 (RRID: AB_2313584)
소 혈청 알부민	시그마-알드리치	A7906
Cy3 AffiniPure 당나귀 안티 래빗 IgG	잭슨 면역 연구소	711-165-152 (RRID:AB_2307443)
DAPI	시그마-알드리치	D9564
Gibco B-27 보충제, 무혈청,	Gibco	17504-044
Matrigel 성장 인자 감소	코닝	354230
mTeSR1	스템셀 기술	85850
팔로이딘A488	라이프 테크놀로지	A12379
포스포-히스톤 H2A. X (Ser139) 항체	세포 신호 기술	2577 (RRID: AB_2118010)
RPMI	Gibco	11875-093
SYBR  녹색 I 핵산 젤 얼룩	Sigma-Aldrich	S9430
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100
UltraPure 저융점 Agarose	Invitrogen	16520050
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000	Antifade