लिवर सेल में मानव Pluripotent स्टेम सेल के कुशल भेदभाव
Summary
इस प्रोटोकॉल में 18 दिनों में मानव pluripotent स्टेम सेल (HPSCs) से hepatocyte की तरह कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक उत्पन्न करने के लिए एक monolayer, सीरम मुक्त विधि का विवरण. यह छह चरणों पर जोर देता है क्योंकि एचपीएससी ने हेपेटोसाइट जैसी कोशिकाओं को बनाने से पहले छह चरणों को क्रमिक रूप से मध्यवर्ती सेल-प्रकारों जैसे आदिम लकीर, निश्चित एंडोडर्म, पीछे की ओर फोरगट और यकृत कली संतति में अंतर किया है।
Abstract
जिगर हानिकारक पदार्थों detoxifies, महत्वपूर्ण प्रोटीन स्रावित करता है, और महत्वपूर्ण चयापचय गतिविधियों को निष्पादित करता है, इस प्रकार जीवन को बनाए रखने. नतीजतन, जिगर की विफलता-जो पुरानी शराब का सेवन, हेपेटाइटिस, तीव्र विषाक्तता, या अन्य अपमान की वजह से हो सकता है- एक गंभीर स्थिति है कि खून बह रहा है, पीलिया, कोमा, और अंत में मौत में खत्म कर सकते हैं. हालांकि, जिगर की विफलता के इलाज के लिए दृष्टिकोण, साथ ही जिगर समारोह और रोग के अध्ययन, मानव जिगर की कोशिकाओं की भरपूर आपूर्ति की कमी से भाग में stymied किया गया है. इस अंत में, इस प्रोटोकॉल में मानव pluripotent स्टेम सेल (एचपीएससी) के कुशल भेदभाव का विवरण हेपेटोसाइट की तरह कोशिकाओं में, एक विकासात्मक रोडमैप द्वारा निर्देशित है जो बताता है कि कैसे जिगर भाग्य लगातार छह भेदभाव चरणों में निर्दिष्ट किया जाता है। जिगर भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए और स्पष्ट रूप से अवांछित सेल भाग्य के गठन को दबाने के लिए विकास संकेत नदेह पथ जोड़ तोड़ करके, इस विधि कुशलतापूर्वक मानव जिगर कली संतति और hepatocyte की तरह कोशिकाओं की आबादी उत्पन्न दिन 6 और पीएससी भेदभाव के 18, क्रमशः. यह एक सीरम मुक्त संस्कृति माध्यम में छोटे अणुओं और विकास कारकों द्वारा लागू विकास संकेतन रास्ते के लौकिक-सटीक नियंत्रण के माध्यम से हासिल की है। इस प्रणाली में भेदभाव monolayers में होता है और पैदावार hepatocyte की तरह कोशिकाओं है कि व्यक्त विशेषता hepatocyte एंजाइमों और पुरानी जिगर की विफलता के एक माउस मॉडल engraft करने की क्षमता है. कुशलतापूर्वक इन विट्रो में मानव जिगर की कोशिकाओं की बड़ी संख्या उत्पन्न करने की क्षमता जिगर की विफलता के इलाज के लिए असर है, दवा स्क्रीनिंग के लिए, और जिगर की बीमारी के मशीनी अध्ययन के लिए.
Introduction
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य मानव pluripotent स्टेम सेल (एचपीएससी) जिगर कली संतानों और hepatocyte की तरह कोशिकाओं2की समृद्ध आबादी में कुशलता पूर्वक अंतर है. मानव जिगर संतति और hepatocyte की तरह कोशिकाओं की एक तैयार आपूर्ति करने के लिए प्रवेश जिगर समारोह और रोग की जांच करने के प्रयासों में तेजी लाने और जिगर की विफलता के लिए नए सेलुलर प्रत्यारोपण चिकित्सा सक्षम हो सकता है3,4, 5. यह अतीत में चुनौतीपूर्ण साबित हो गया है के बाद से hPSCs (जो भ्रूण और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल शामिल हैं) मानव शरीर के सभी सेल प्रकार में अंतर कर सकते हैं; फलस्वरूप, उन्हें केवल एकल कोशिका-प्रकार की शुद्ध जनसंख्या में अंतर करनाकठिन हो गया है, जैसे यकृत कोशिकाएं 6।
ठीक जिगर की कोशिकाओं में hPSCs अंतर करने के लिए, पहले यह न केवल कैसे जिगर की कोशिकाओं को निर्दिष्ट कर रहे हैं, लेकिन यह भी कैसे गैर जिगर सेल प्रकार विकसित समझने के लिए महत्वपूर्ण है. कैसे गैर जिगर कोशिकाओं का विकास का ज्ञान भेदभाव के दौरान गैर जिगर वंश के गठन को तार्किक रूप से दबाने के लिए महत्वपूर्ण है, जिससे विशेष रूप से एक जिगर भाग्य2की ओर hPSCs मार्गदर्शन . दूसरा, यह कई विकासात्मक चरणों जिसके माध्यम से hPSCs एक जिगर भाग्य की ओर अंतर वर्णन करने के लिए आवश्यक है. यह ज्ञात है कि एचपीएससी ने हेपेटोसाइट-जैसे कोशिकाओं (एचईपी) बनाने से पहले कई सेल-प्रकारों में क्रमिक रूप से अंतर किया है जिसे आदिम लकीर (एपीएस), निश्चित एंडोडर्म (डीई), पश्च फोर्ट (पीएफजी) और यकृत कली संतति (एलबी) के रूप में जाना जाता है। इससे पहले काम जिगर भाग्य और संकेत है कि वैकल्पिक गैर जिगर सेल प्रकार के गठन को दबा संकेत से पता चला (पेट सहित, अग्नाशय, और आंतों संतति) प्रत्येक विकासवंशी पसंद2पर , 7 , 8.
सामूहिक रूप से, इन अंतर्दृष्टि आदिम लकीर, निश्चित endoderm, पीछे foregut, जिगर कली संतति और अंत में, hepatocyte की तरह कोशिकाओं2की ओर hPSCs अंतर करने के लिए एक सीरम मुक्त, मोनोलेयर विधि को जन्म दिया है. कुल मिलाकर विधि एक उचित घनत्व पर एक मोनोलेयर में hPSCs के बोने शामिल है, भेदभाव मीडिया के छह कॉकटेल की तैयारी (विकास कारकों और छोटे अणुओं है कि विभिन्न विकासात्मक संकेतन रास्ते को विनियमित युक्त), और क्रमिक रूप से 18 दिनों के दौरान भेदभाव पैदा करने के लिए इन मीडिया को जोड़ने. इस प्रक्रिया के दौरान, कोशिकाओं के पासिंग की आवश्यकता नहीं है। नोट की, क्योंकि इस विधि स्पष्ट रूप से संकेत है कि गैर-जिगर सेल प्रकार के गठन को दबाने भी शामिल है, इस भेदभाव दृष्टिकोण1 और अधिक कुशलता से जिगर संतति और hepatocyte की तरह कोशिकाओं वर्तमान की तुलना से उत्पन्न करता है विभेद नकरने के तरीके2,9,10,11,12. इसके अलावा, इस पाठ में वर्णित प्रोटोकॉल hepatocytes की तेजी से पीढ़ी है कि अंततः अन्य प्रोटोकॉल द्वारा उत्पादित उन लोगों की तुलना में यकृत प्रतिलेखन कारकों और एंजाइमों के उच्च स्तर को व्यक्त सक्षम बनाता है9,10 , 11 , 12.
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल वर्तमान भेदभाव प्रोटोकॉल पर कुछ लाभ है. सबसे पहले, यह hPSCs के मोनोलेयर भेदभाव पर जोर देता है, जो तकनीकी रूप से तीन आयामी भेदभाव तरीकों की तुलना में सरल है, जैसे कि वे जो भ्रूणीय निकायों13पर भरोसा करते हैं। दूसरा, इस विधि एक हाल ही में अग्रिम जिससे निश्चित endoderm कोशिकाओं (जिगर की कोशिकाओं के लिए एक प्रारंभिक अग्रदूत) कुशलतापूर्वक और तेजी से hPSC भेदभाव2के 2 दिनों के भीतर उत्पन्न किया जा सकता है ,7,इस प्रकार बाद को सक्षम करने से शोषण बढ़ी हुई शुद्धता के साथ hepatocytes का उत्पादन. तीसरा, साथ-साथ तुलना में, इस विधि द्वारा उत्पादित hepatocyte की तरह कोशिकाओं2 अधिक ALBUMIN उत्पादन और अन्य तरीकों में उत्पादित hepatocytes की तुलना में यकृत प्रतिलेखन कारकों और एंजाइमों के उच्च स्तर को व्यक्त10, 11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस विधि जिगर कली संतति की समृद्ध आबादी की पीढ़ी सक्षम बनाता है, और बाद में hepatocyte की तरह कोशिकाओं, hPSCs से. मानव जिगर की कोशिकाओं की समृद्ध आबादी उत्पन्न करने की क्षमता ऐसी कोशिकाओं के व्यावहारिक उपयोग के लिए …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम चर्चा के लिए बिंग लिम और स्टेम सेल जीव विज्ञान और पुनर्योजी चिकित्सा के लिए बुनियादी ढांचे के समर्थन के लिए स्टैनफोर्ड संस्थान धन्यवाद. यह काम पुनर्योजी चिकित्सा के लिए कैलिफोर्निया संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था (DISC2-10679) और स्टैनफोर्ड-यूसी बर्कले Siebel स्टेम सेल संस्थान (L.T.A. और K.M.L.) और स्टैनफोर्ड Beckman परमाणु और आनुवंशिक चिकित्सा के लिए केंद्र के रूप में अच्छी तरह से बेनामी, Baxter और DiGenova परिवारों (के.एम.एल.) के लिए.
Materials
| Geltrex | Thermofisher Scientific | A1569601 | |
| 1:1 DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| 0.2 μm pore membrane filter | Millipore | GTTP02500 | |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Thiazovivin | Tocris Bioscience | 3845 | |
| Accutase | Gibco or Millipore | Gibco A11105, Millipore SCR005 | |
| IMDM, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31980030 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31765035 | |
| KOSR, Knockout serum replacement | Thermofisher Scientific | 10828028 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | 10652202001 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Thermofisher Scientific | 11905031 | |
| human Activin | R&D | 338-AC | |
| CHIR99201 | Tocris | 4423 | |
| PI103 | Tocris | 2930/1 | |
| human FGF2 | R&D | 233-FB | |
| DM3189 | Tocris | 6053/10 | |
| A83-01 | Tocris | 2939/10 | |
| Human BMP4 | R&D | 314-BP | |
| C59 | Tocris | 5148 | |
| TTNPB | Tocris | 0761/10 | |
| Forskolin | Tocris | 1099/10 | |
| Oncostatin M | R&D | 295-OM | |
| Dexamethasone | Tocris | 1126 | |
| Ro4929097 | Selleck Chem | S1575 | |
| AA2P | Cayman chemicals | 16457 | |
| human recombinant Insulin | Sigma-Aldrich | 11061-68-0 |
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