Kvantitativ undersøgelse af antibiotika følsomhed af Neisseria gonorrhoeae aggregater bruger ATP-udnyttelse kommercielle Assays og Live/døde farvning
Summary
En simpel måling af ATP assay og live/døde farvning metode blev brugt til at kvantificere og visualisere Neisseria gonorrhoeae overlevelse efter behandling med ceftriaxon. Denne protokol kan udvides til at undersøge enhver antibiotikum antimikrobielle virkninger og kan bruges til at definere den minimale hæmmende koncentration af antibiotika i bakterielle biofilm.
Abstract
Fremkomsten af antibiotika-resistente Neisseria gonorrhoeae (GC) er et verdensomspændende sundhedstrussel og fremhæver behovet for at identificere personer, der ikke behandling. Denne Gram-negative bakterier forårsager gonoré udelukkende hos mennesker. Under infektion er den købedygtig form aggregater og/eller biofilm. Den mindste hæmmende koncentration (MIC) test bruges til at bestemme følsomhed over for antibiotika og fastlægge passende behandling. Mekanismen af udryddelse in vivo og dens forhold til laboratorieresultaterne kendes dog ikke. Blev udviklet en metode, der undersøger hvordan GC sammenlægning påvirker antibiotikaresistens og viser forholdet mellem samlede størrelse og antibiotikaresistens. Når GC aggregat, de er mere resistente over for antibiotika drab, overlevende med bakterier i midten ceftriaxon behandling bedre end i periferien. Dataene angiver, at N. gonorrhoeae sammenlægning kan reducere dets modtagelighed for ceftriaxon, hvilket ikke afspejles ved hjælp af standard agar plade-baserede MIC metoder. Metoden i denne undersøgelse giver forskere til at teste bakteriel følsomhed under klinisk relevante forhold.
Introduction
Gonoré er et fælles seksuelt overført infektion (TSI)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), en Gram-negative diplococcal bakterie, er den udløsende agens af denne sygdom. Symptomerne på genital infektion kan resultere i smerter under vandladning, generaliseret genital smerte og urethrae udledning. Infektionen er ofte asymptomatisk2,3,4,5, og dette giver mulighed for udvidede kolonisering. Disse ubehandlede infektioner er en større sundhedsmæssig bekymring, som de har potentiale til at lette transmission af organismen, og dette kan føre til komplikationer såsom bækkenbetændelse (PID) og formidlet gonococcal infektion (DGI)6. Antibiotikaresistente gonoré er en større folkesundhedskrise og en øget samfundsøkonomisk byrde7. Reduceret følsomhed over for cefalosporiner har resulteret i behandling Régimen ændring fra et enkelt antibiotikum dual therapy, som kombinerer azithromycin eller doxycyklin med ceftriaxon8. Ceftriaxon og azithromycin9,10, i kombination med asymptomatiske infektioner, øget fiasko understreger behovet for forståelse gonoré behandling fiaskoer.
Den mindste hæmmende koncentration (MIC) test, herunder agar fortynding og disc diffusion tests, har været brugt som standard medicinsk test for at identificere resistens over for et antibiotikum. Det er dog uklart, om MIC test afspejler bakteriel antibiotikaresistens in vivo. Dannelsen af bakterielle biofilm bidrager til overlevelse af bakterier i nærværelse af bakteriedræbende koncentrationer af antibiotikum: mikrofon test er i stand til at opdage denne effekt11. Fordi GC kan danner biofilm på slimhindeinfektioner12, vi hypotesen, at antibiotikum modtagelighed i aggregater ville være forskellige fra, ses i enkelte GC. Desuden, har undersøgelser vist at trefaset variable overflade molekyler, Pili, opacitet-forbundet protein (Opa), og lipooligosaccharides (LOS), at regulerer Inter bakterie interaktioner, føre til forskellige størrelse aggregater13, 14 , 15. bidrag af disse komponenter til antibiotikaresistens er ikke blevet undersøgt på grund af manglen på ordentlig metoder.
I øjeblikket, er der flere metoder til at måle biofilm udryddelse. Den mest udbredte kvantitative metode er ved at måle ændringer i biomasse ved hjælp af krystalviolet farvning16. Metoden kræver imidlertid betydelig eksperimentelle manipulation, der potentielt kan generere fejl i eksperimentet gentager17. Live/døde farvnings-metoden bruges her giver mulighed for visualisering af levende og døde bakterier og deres fordeling i biofilm. Dog kan biofilm struktur optræde som en fysisk barriere, der reducerer farvestof penetration. Derfor, for at kvantificere live/døde bakterier inden for en gruppe, farvning er begrænset til små biofilm eller dens forløber-microcolonies eller sammenlægninger. Andre metoder, herunder agar fortynding og disc diffusion-testene er ikke i stand til at måle virkningerne af sammenlægning. At undersøge GC modtagelighed inden for sammenlægning efter antibiotisk eksponering, en ideel metode ville har brug for at have både en kvantitativ analyse, der kan måle live bakterier og visualisere deres distribution.
Proceduren beskrevet her kombinerer en ATP-udnyttelse måling og en live/døde farvning assay til kvantitativt og visuelt undersøge GC modtagelighed i aggregater under tilstedeværelse af antibiotika.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bakterier kan danne biofilm under infektion af det menneskelige legeme. Traditionelle MIC test kan ikke afspejle den koncentration, der er nødvendige for at udrydde bakterier i en biofilm. For at teste antimikrobielle virkninger på en biofilm, kan metoder baseret på biofilm biomasse samt plating CFUs være forkert på grund af virkningen af biofilm struktur. For eksempel, virker plating metode kun hvis biofilm kan være afbrudt. Derfor, CFU fremstillet kan være lavere end det faktiske antal levedygtige bakterier. Vis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra National Institute of Health D.C.S. og WS AI123340. L.-C.W., J.W., A.C., og E.N. blev støttet i del/deltage i “Den første års Innovation & forskning Experience” program finansieret af University of Maryland. Finansieringskilderne spillede ingen rolle i undersøgelse design, dataindsamling og analyse, beslutningen om at offentliggøre eller forberedelse af manuskriptet. Vi anerkender UMD CBMG Imaging kernen for alle mikroskopi eksperimenter.
Materials
| 100x Kellogg's supplement | |||
| Agar | United States Biological | A0930 | |
| BacTiter Assay | Promega | G8232 | |
| Ceftriaxone | TCI | C2226 | |
| Difco GC medium base | BD | 228950 | |
| Ferric nitrate, nonahydrate | Sigma-Aldrich | 254223-10G | |
| Glucose | Thermo Fisher Scientific | BP350-1 | |
| L-glutamine Crystalline Powder | Fisher Scientific | BP379-100 | |
| BacLight live/dead staining | Invitrogen | L7012 | |
| MS11 Neisseria gonorrhoeae strain | kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research | ||
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | P290-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Proteose Peptone | BD Biosciences | 211693 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-10 | |
| Soluble Starch | Sigma-Aldrich | S9765 | |
| Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754-5G | |
| Equipment | |||
| Petri Dishes | VWR | 25384-302 | |
| 8-well coverslip-bottom chamber | Thermo Fisher Scientific | 155411 | |
| 96-well tissue culture plates | Corning, Falcon | 3370 | |
| Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood) | Nuaire | 32776 | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | Model 3530 | |
| Confocal microscope equipped with live imaging chamber | Leica | SP5X | |
| Corning 96 Well Black Polystyrene Microplate | Corning | 3904 | |
| Glomax Illuminator | Promega | E6521 | |
| Pipette tips (0.1-10 µL) | Thermo Fisher Scientific | 02-717-133 | |
| Pipette tips (1000 µL) | VWR | 83007-382 | |
| Pipette tips (200 µL) | VWR | 53509-007 | |
| Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV | Pharmacia Biotech | 80-2106-00 | |
| Sterile 15 ml conical tubes | VWR | 21008-216 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL) | Sorenson BioScience | 16070 | |
| Sterile polyester-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-122 | |
| Sonicator | Kontes | Equivelent to 9110001 |
References
- den Heijer, C. D., et al. A comprehensive overview of urogenital, anorectal and oropharyngeal Neisseria gonorrhoeae testing and diagnoses among different STI care providers: a cross-sectional study. BMC Infectious Diseases. 17 (1), (2017).
- Hein, K., Marks, A., Cohen, M. I. Asymptomatic gonorrhea: prevalence in a population of urban adolescents. The Journal of Pediatrics. 90 (4), 634-635 (1977).
- Hananta, I. P., et al. Gonorrhea in Indonesia: High Prevalence of Asymptomatic Urogenital Gonorrhea but No Circulating Extended Spectrum Cephalosporins-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strains in Jakarta, Yogyakarta, and Denpasar, Indonesia. Sexually Transmitted Diseases. 43 (10), 608-616 (2016).
- Chlamydia, W. H. O. Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, syphilis and Trichomonas vaginalis. Methods and results used by WHO to generate 2005 estimates. World Health Organisation, 2011. Prevalence and incidence of selected sexually transmitted infections. World Health Organisation. , (2011).
- Mayor, M. T., Roett, M. A., Uduhiri, K. A. Diagnosis and management of gonococcal infections. American Family Physician. 86 (10), 931-938 (2012).
- Alirol, E., et al. Multidrug-resistant gonorrhea: A research and development roadmap to discover new medicines. PLOS Medicine. 14 (7), (2017).
- Workowski, K. A., Bolan, G. A. Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2015. MMWR Recommendations and Reports. 64, 1-137 (2015).
- Lahra, M. M., et al. Cooperative Recognition of Internationally Disseminated Ceftriaxone-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strain. Emerging Infectious Diseases. 24 (4), (2018).
- Wi, T., et al. Antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae: Global surveillance and a call for international collaborative action. PLOS Medicine. 14 (7), 1002344 (2017).
- Singh, S., Singh, S. K., Chowdhury, I., Singh, R. Understanding the Mechanism of Bacterial Biofilms Resistance to Antimicrobial Agents. Open Microbiology Journal. 11, 53-62 (2017).
- Greiner, L. L., et al. Biofilm Formation by Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 73 (4), 1964-1970 (2005).
- Zollner, R., Oldewurtel, E. R., Kouzel, N., Maier, B. Phase and antigenic variation govern competition dynamics through positioning in bacterial colonies. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
- Stein, D. C., et al. Expression of Opacity Proteins Interferes with the Transmigration of Neisseria gonorrhoeae. across Polarized Epithelial Cells. PLoS One. 10 (8), 0134342 (2015).
- LeVan, A., et al. Construction and characterization of a derivative of Neisseria gonorrhoeae strain MS11 devoid of all opa genes. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6468-6478 (2012).
- Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O’Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Curr Protoc Microbiol. , (2005).
- Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
- White, L. A., Kellogg, D. S. Neisseria Gonorrhoeae Identification in Direct Smears by a Fluorescent Antibody-Counterstain Method. Journal of Applied Microbiology. 13, 171-174 (1965).
- Swanson, J., Kraus, S. J., Gotschlich, E. C. Studies on gonococcus infection. I. Pili and zones of adhesion: their relation to gonococcal growth patterns. Journal of Experimental Medicine. 134 (4), 886-906 (1971).
- Herten, M., et al. Rapid in Vitro Quantification of S. aureus Biofilms on Vascular Graft Surfaces. Frontiers in Microbiology. 8, 2333 (2017).
- Gracia, E., et al. In vitro development of Staphylococcus aureus biofilms using slime-producing variants and ATP-bioluminescence for automated bacterial quantification. Luminescence. 14 (1), 23-31 (1999).
- Webb, J. S., et al. Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Journal of Bacteriology. 185 (15), 4585-4592 (2003).
- Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide. Journal of visualized experiments. (47), (2011).
- Wang, L. C., Litwin, M., Sahiholnasab, Z., Song, W., Stein, D. C. Neisseria gonorrhoeae Aggregation Reduces Its Ceftriaxone Susceptibility. Antibiotics (Basel). 7 (2), (2018).
- Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 510-543 (2014).
- Hall-Stoodley, L., et al. Towards diagnostic guidelines for biofilm-associated infections. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 127-145 (2012).
