정량 검사의 항생제 자화 율 Neisseria gonorrhoeae 집계를 사용 하 여 ATP 이용 상업적인 분석 실험 및 라이브/죽은 얼룩

Summary

간단한 ATP 측정 분석 결과 및 라이브/죽은 방법 얼룩 계량 ceftriaxone 치료 후 Neisseria gonorrhoeae 생존을 시각화 하 사용 되었다. 이 프로토콜 검사 어떤 항생제의 항균 효과를 확장할 수 있습니다 고 박테리아 biofilms에서 항생제의 최소 억제 농도 정의 하기 위해 사용할 수 있습니다.

Abstract

항생제 내성 Neisseria gonorrhoeae (GC)의 출현은 세계적인 건강 위협이 고 치료 하지 못하는 개인을 식별 하는 필요를 강조. 이 그램 음성 박테리아는 인간에서 독점적으로 임 질을 발생합니다. 감염, 동안 양식 집계 biofilms 하 수 있다. 최소 억제 농도 (MIC) 테스트 항생제 자화 율을 결정 하 고 적절 한 치료를 정의 하기 위해 사용 됩니다. 그러나, vivo에서 박멸 및 실험실 결과 관계의 메커니즘은 알려져 있지 않습니다. GC 집계 항생제 자화 율에 영향을 미치는 방법과 집계 크기와 항생제 자화 율 사이의 관계를 표시를 검사 하는 방법 개발 되었다. 때 GC 집계, 그들은 더 죽이 항생제에 저항력이, 센터에서 박테리아와 함께 주변에 그 보다 더 나은 ceftriaxone 치료를 생존. 데이터 표시 N. gonorrhoeae 집계 표준 한 천 격판덮개 기반 마이크 메서드를 사용 하 여 반영 되지 않습니다 ceftriaxone의 민감성을 줄일 수 있습니다. 이 연구에 사용 되는 방법은 연구자 임상 관련 조건 하에서 세균 자화 율 테스트를 수 있습니다.

Introduction

임 질은 일반적인 성병 감염 (STI)¹. Neisseria gonorrhoeae (GC), 그람 음성 diplococcal 박테리아는이 질병의 원인이 되는 대리인. 생식 기 감염의 증상 통증 배 뇨, 일반화 된 생식 기 통증, 그리고 요도 방전 하는 동안 발생할 수 있습니다. 감염이 종종 무 증상^2,3,,45, 이며 이로써 확장된 식민. 그들은 유기 체의 전송을 촉진 가능성이 있고이 골반 염증 성 질환 (PID) 등의 합병증으로 이어질 수 있습니다 gonococcal 감염 (DGI)⁶전파 이러한 치료 감염 주요 건강 관심사는. 항생제 내성 임 질은 중요 한 공중 위생 위기와 증가 사회경제적 부담⁷. Cephalosporins 감소 민감성 ceftriaxone⁸azithromycin 또는 doxycycline 결합 듀얼 치료에서 단일 항생제 치료 처방 변경 결과입니다. Ceftri....

Protocol

1. 일반적인 유지 보수의 GC 변종

1. N. gonorrhoeae 긴장 행진 1% GCK agar에 켈로그¹⁸ (표 1, 표 2) 냉장고 주식에서 보충 하 고 5% CO₂ 16-18 헤 사용 MS11 단계 변수 Opa (MS11Opa +), 아니 Opa (MS11ΔOpa), 표현에 대 한 37 ° C를 품 어 또는 잘린된 로스 (MS11ΔLgtE)입니다.
2. 신중 하 게 부정적인 pili (어두운 가장자리 없이 식민지) 또는 양성 (어두운 가장자리 식민지) 식민지 식민지 형태학¹⁹ 해 가벼운 현미경 및 새로운 GCK 플레이트에 연속 사용에 따라 각 스트레인에서 선택 합니다.
3. 사용 하기 전에 16-18 h 5% CO₂ 와 37 ° C에서 품 어.

2. 생존 GC 집계의 정량화

1. 메 마른 주걱을 사용 하 여 GC를 수집 합니다. 면봉 접시에서 GC와 미리 데워 국물 (GCP, 표 3)에 다시 중단 GC 1%와 4.2% NaHCO₃ 켈로그 솔루션

Results

두 가지 방법을 사용 했다: ATP 사용률 분석 결과 및 라이브/죽은 얼룩 분석 결과. 결과 결합 하거나 개별적으로 항생제 치료 후 집계 내 세균 생존을 검토를 위해 사용 될 수 있습니다 합니다. ATP 사용률 분석 결과 미 균 biofilms^20,21에서 정확 하 게 실행 가능한 박테리아를 측정 하기 위해 표시 되었습니다. 여기, MS11Opa + 필 + 스트레인 항생제 자화 율에서 GC 집계의 역할 검사 사용 되었다. 비 집계 MS11Opa + 필 +, 집계 MS11Opa + 필 +, 또는 집계 및 다음 쥡니다 MS11Opa + 필에 의해 중단 + 직렬 희석 ceftriaxone 및 ATP 수준 측정 (그림 1A)로 치료 했다. 비교 백분율 생존와 항생제 치료를 하.......

Discussion

박테리아는 인체 감염 시 biofilms을 형성할 수 있다. 전통적인 마이크 테스트는 biofilm에서 박테리아를 박멸 하는 데 필요한 농도 반영 되지 않을 수 있습니다. biofilm에 항균 효과 테스트 하려면 방법 biofilm 바이오 매스를 기반으로 CFUs 도금 biofilm 구조의 영향으로 인해 잘못 된 될 수 있습니다. 예를 들어 도금 방법은는 biofilm 중단 될 수 있습니다 하는 경우 작동 합니다. 따라서, 얻은 CFU 실행 가능한 박테리아의 실제 번호 보다 낮은 수 있습니다. 그러나 머릿속 죽은 및 라이브 박테리아는 biofilm 내의 측정 biofilm 내의 박테리아의 생존에 대 한 설립 되었습니다,, 구조와 biofilm의 밀도 따라 얼룩이 지는 실패할 수 있습니다는 biofilm에 침투 하 여 발생 한 부정확 하 고 과소 평가 생존 속도입니다.

여기 방법의 치료 후 세균 생존을 측정 하는 양적 및 시각화 분석 결과 사용 합니다. 이 방법의 장점은 실제 감염.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x Kellogg의 보충제
Agar	United States Biological	A0930
BacTiter Assay	Promega	G8232
Ceftriaxone	TCI	C2226
Difco GC 중간 베이스	BD	228950
질산철, 비수화물	Sigma-Aldrich	254223-10G
포도	Thermo Fisher Scientific	BP350-1
L-글루타민 결정성 분말	Fisher Scientific	BP379-100
BacLight 생염색/사염색	Invitrogen	L7012
MS11 Neisseria gonorrhoeae 균주			Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute가 친절하게 제공했습니다. 연구
산칼륨 이염기성 (K2HPO4)Fisher	Scientific	P290-500
인산칼륨 일염기성 (KH2PO4)	Fisher Scientific	BP329-1
프로테오스 펩톤	BD Biosciences	211693
염화나트륨 (NaCl)	Fisher Scientific	S671-10
가용성 전분	Sigma-Aldrich	S9765
티아민 피로 인산	Sigma-Aldrich	C8754-5G
장비
페트리 접시	VWR	25384-302
8-well 커버슬립 바닥 챔버	Thermo Fisher Scientific	155411
96웰 조직 배양 플레이트	Corning, Falcon	3370
Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood)	Nuaire	32776
CO2 인큐베이터	Fisher Scientific	라이브 이미징 챔버가 장착된 모델 3530
컨포칼 현미경	Leica	SP5X
Corning  96 웰 블랙 폴리스티렌 마이크로플레이트	코닝	3904
글로맥스 일루미네이터	Promega	E6521
피펫 팁(0.1-10 &마이크로; L)	Thermo Fisher Scientific	02-717-133
피펫 팁(1000 &마이크로; L)	VWR	83007-382
피펫 팁 (200 µ L)	VWR	53509-007
분광 광도계 Ultrospec 2000 UV	Pharmacia Biotech	80-2106-00
멸균 15ml 원추형 튜브	VWR	21008-216
멸균 마이크로 원심분리기 튜브(1.7mL)	Sorenson BioScience	16070
멸균 폴리에스터 팁 애플리케이터	Fisher Scientific	23-400-122
Sonicator	Kontes	9110001