Summary

Quantitative Untersuchung der Antibiotikaempfindlichkeit von Neisseria Gonorrhoeae Aggregate verwenden ATP-Auslastung kommerziellen Assays und Live/Dead Färbung

Published: February 08, 2019
doi:

Summary

Eine einfache Messung der ATP Assay und lebenden/Toten Färbung Methode dienten zu quantifizieren und zu visualisieren, Neisseria Gonorrhoeae Überleben nach Behandlung mit Ceftriaxon. Dieses Protokoll kann verlängert werden, um die antimikrobielle Wirkung der jedes Antibiotikum zu untersuchen und kann verwendet werden, um die minimalen inhibitorischen Konzentration der Antibiotika bei bakteriellen Biofilmen definieren.

Abstract

Die Entstehung von Antibiotika-resistenten Neisseria Gonorrhoeae (GC) ist ein weltweit Gesundheitsrisiko dar und unterstreicht die Notwendigkeit, Personen zu identifizieren, die Behandlung nicht. Dieses gramnegatives Bakterium verursacht Gonorrhoe ausschließlich beim Menschen. Während der Infektion ist es in der Lage, Form Aggregate und/oder Biofilme. Der minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) Test dient für Anfälligkeit gegen Antibiotika zu bestimmen und entsprechenden Behandlung zu definieren. Der Mechanismus der die Beseitigung der in-vivo und ihre Beziehung zur Laborergebnisse sind nicht bekannt. Eine Methode, die untersucht, wie GC Aggregation Antibiotikaempfindlichkeit beeinflusst und zeigt die Beziehung zwischen aggregierte Größe und Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika wurde entwickelt. Wenn GC Aggregat sie resistenter gegen Antibiotika töten sind, überleben mit Bakterien im Zentrum Ceftriaxon-Behandlung besser als in der Peripherie. Die Daten zeigen, dass N. Gonorrhoeae Aggregation seiner Anfälligkeit für Ceftriaxon, reduzieren kann, was nicht mit den standard Agar-Platte-basierte MIC Methoden widerspiegelt. In dieser Studie verwendete Methode ermöglicht es Forschern, bakterielle Anfälligkeit unter klinisch relevanten Bedingungen zu testen.

Introduction

Gonorrhoe ist eine gemeinsame sexuell übertragbare Infektionen (STI)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), ein gramnegatives diplococcal Bakterium ist der Erreger dieser Krankheit. Symptome der genitalen Infektion führt zu Schmerzen beim Wasserlassen, generalisierte genitale Schmerzen und Harnröhre entladen. Infektion ist oft asymptomatisch2,3,4,5, und dies ermöglicht eine erweiterte Kolonisation. Diese unbehandelten Infektionen sind ein großes gesundheitliches Problem, da sie das Potenzial, die Übertragung des Organismus zu erleichtern und dies kann zu Komplikationen wie Adnexitis (PID) und verbreitet Gonokokken-Infektion (DGI)6. Antibiotika-resistenten Tripper ist eine Krise des öffentlichen Gesundheitswesens und eine zunehmende sozioökonomische Last7. Geringere Anfälligkeit für Cephalosporine führte Behandlung Therapie Wechsel von ein einziges Antibiotikum zur dualen Therapie verbindet Azithromycin oder Doxycyclin mit Ceftriaxon8. Das erhöhte Scheitern von Ceftriaxon und Azithromycin9,10, in Kombination mit asymptomatische Infektionen, unterstreicht die Notwendigkeit der Gonorrhoe Behandlungsversagen zu verstehen.

Der minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC)-Test, einschließlich der Agar-Verdünnung und Disc-Diffusion-Tests, wurde als der standard medizinischer Test zur Identifizierung von Widerstand gegen ein Antibiotikum eingesetzt. Es ist jedoch unklar, ob der MIC Test bakterielle Resistenz gegen Antibiotika in-vivo widerspiegelt. Die Entstehung von bakteriellen Biofilmen trägt für das Überleben der Bakterien im Beisein von bakterizide Konzentrationen des Antibiotikums: die MIC-Tests sind nicht in der Lage, diesen Effekt11zu erkennen. Weil GC auf Schleimhaut-Oberflächen12Biofilme bilden kann, wir stellen die Hypothese auf, dass Antibiotikum Anfälligkeit innerhalb Aggregate wäre anders als in einzelnen GC gesehen. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass drei–Variable Oberflächenmoleküle, Pili, Deckkraft-assoziierten Protein (Opa Phasen) und Lipooligosaccharides (LOS), die Inter Bakterie Interaktionen regulieren, zu verschiedenen großen Aggregate13, führen 14 , 15. der Beitrag dieser Komponenten zu Antibiotika-Resistenz wurde nicht durch den Mangel an geeigneten Methoden geprüft.

Derzeit gibt es mehrere Methoden, um die Beseitigung der Biofilm zu messen. Die am weitesten verbreitete quantitative Methode ist durch Messung der Biomasse mit Kristallviolett16Färbung. Die Methode erfordert jedoch erhebliche experimentelle Manipulation, die möglicherweise Fehler im Experiment wiederholt17erzeugen kann. Die lebenden/Toten Färbung Methode hier ermöglicht die Visualisierung von lebenden und toten Bakterien und deren Verteilung innerhalb der Biofilm. Die Biofilm-Struktur kann jedoch als eine physikalische Barriere darstellen, die Farbstoff eindringen reduziert. Daher beschränkt sich um lebenden/Toten Bakterien innerhalb einer Gruppe zu quantifizieren, die Färbung auf kleine Biofilmen oder seine Vorläufer-Mikrokolonien oder Aggregationen. Andere Methoden, einschließlich der Agar Verdünnung und Disc Verbreitung Tests sind nicht in der Lage, die Auswirkungen der Aggregation zu messen. GC-Anfälligkeit in Aggregation nach antibiotische Belichtung, eine ideale Methode untersuchen brauchen haben beide ein quantitativen Assay, der messen kann lebende Bakterien und deren Verteilung zu visualisieren.

Das hier beschriebene Verfahren kombiniert eine ATP-Nutzung-Messung und einer lebenden/Toten Färbung quantitativ zu bestimmen und visuell prüfen GC Anfälligkeit innerhalb Aggregate in Anwesenheit von Antibiotika.

Protocol

1. Allgemeine Wartung von GC-Stämme N. Gonorrhoeae Stämme Streifen auf GCK-Agar mit 1 % Kellogg ergänzt18 (Tabelle 1, Tabelle 2) aus den Beständen der Gefrierschrank und inkubieren Sie 37 ° C mit 5 % CO2 für 16-18 h Nutzung MS11 Ausdruck Phase-Variable Opa (MS11Opa +), keine Opa (MS11ΔOpa), oder einen abgeschnittenen LOS (MS11ΔLgtE). Wählen Sie sorgfältig Pili negative (Kolonie ohne dunkle Kante) oder positiv (Kolonie mit dunklen R…

Representative Results

Zwei Methoden wurden eingesetzt: eine ATP-Nutzung-Assay und einen lebenden/Toten-Färbung-Assay. Die Ergebnisse können kombiniert oder einzeln verwendet für die Prüfung von bakteriellen überleben in Aggregate nach Behandlung mit Antibiotika. Der ATP-Nutzung-Test hat sich gezeigt, genau lebensfähige Bakterien in S. Aureus Biofilme20,21messen. Hier, wurde MS11Opa + Pil + Stamm verwendet, um die Rolle der GC Aggregation…

Discussion

Bakterien können Biofilme bilden, während der Infektion des menschlichen Körpers. Traditionelle kann MIC die Konzentration erforderlich, um die Beseitigung der Bakterien im Biofilm reflektieren nicht. Um Antibiotika Auswirkungen auf einen Biofilm zu testen, können Methoden auf Basis von Biofilm Biomasse sowie die Beschichtung KBE aufgrund der Auswirkungen der Biofilm Struktur fehlerhaft sein. Beispielsweise funktioniert die Beschichtung-Methode nur, wenn der Biofilm gestört werden kann. Daher kann die KBE erhalten n…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde unterstützt durch ein Stipendium des National Institute of Health, D.C.S. und w.s. AI123340. L.-c.w., j.w., A.C. und E.N wurden in Teil/Teilnahme an “The First Year Innovation & Forschung Experience”-Programm von der University of Maryland finanziert unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle bei der Studie Design, Datenerhebung und -Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder der Manuskripterstellung. Wir anerkennen die UMD CBMG Imaging Core für alle Mikroskopie-Experimente.

Materials

100x Kellogg's supplement
Agar United States Biological A0930
BacTiter Assay  Promega G8232
Ceftriaxone TCI C2226
Difco GC medium base  BD 228950
Ferric nitrate, nonahydrate  Sigma-Aldrich 254223-10G
Glucose Thermo Fisher Scientific BP350-1
L-glutamine Crystalline Powder Fisher Scientific BP379-100
BacLight live/dead staining Invitrogen L7012
MS11 Neisseria gonorrhoeae strain kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) Fisher Scientific P290-500
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Fisher Scientific BP329-1
Proteose Peptone  BD Biosciences 211693
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S671-10
Soluble Starch Sigma-Aldrich S9765
Thiamine pyrophosphate Sigma-Aldrich C8754-5G
Equipment
Petri Dishes VWR 25384-302
8-well coverslip-bottom chamber  Thermo Fisher Scientific 155411
96-well tissue culture plates  Corning, Falcon 3370
Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood) Nuaire 32776
CO2 Incubator Fisher Scientific  Model 3530
Confocal microscope equipped with live imaging chamber Leica SP5X
Corning  96 Well Black Polystyrene Microplate  Corning 3904
Glomax Illuminator  Promega E6521
Pipette tips (0.1-10 µL) Thermo Fisher Scientific 02-717-133
Pipette tips (1000 µL) VWR 83007-382
Pipette tips (200 µL) VWR 53509-007
Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV Pharmacia Biotech 80-2106-00
Sterile 15 ml conical tubes VWR 21008-216
Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL) Sorenson BioScience 16070
Sterile polyester-tipped applicators Fisher Scientific 23-400-122
Sonicator Kontes Equivelent to 9110001

References

  1. den Heijer, C. D., et al. A comprehensive overview of urogenital, anorectal and oropharyngeal Neisseria gonorrhoeae testing and diagnoses among different STI care providers: a cross-sectional study. BMC Infectious Diseases. 17 (1), (2017).
  2. Hein, K., Marks, A., Cohen, M. I. Asymptomatic gonorrhea: prevalence in a population of urban adolescents. The Journal of Pediatrics. 90 (4), 634-635 (1977).
  3. Hananta, I. P., et al. Gonorrhea in Indonesia: High Prevalence of Asymptomatic Urogenital Gonorrhea but No Circulating Extended Spectrum Cephalosporins-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strains in Jakarta, Yogyakarta, and Denpasar, Indonesia. Sexually Transmitted Diseases. 43 (10), 608-616 (2016).
  4. Chlamydia, W. H. O. Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, syphilis and Trichomonas vaginalis. Methods and results used by WHO to generate 2005 estimates. World Health Organisation, 2011. Prevalence and incidence of selected sexually transmitted infections. World Health Organisation. , (2011).
  5. Mayor, M. T., Roett, M. A., Uduhiri, K. A. Diagnosis and management of gonococcal infections. American Family Physician. 86 (10), 931-938 (2012).
  6. Alirol, E., et al. Multidrug-resistant gonorrhea: A research and development roadmap to discover new medicines. PLOS Medicine. 14 (7), (2017).
  7. Workowski, K. A., Bolan, G. A. Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2015. MMWR Recommendations and Reports. 64, 1-137 (2015).
  8. Lahra, M. M., et al. Cooperative Recognition of Internationally Disseminated Ceftriaxone-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strain. Emerging Infectious Diseases. 24 (4), (2018).
  9. Wi, T., et al. Antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae: Global surveillance and a call for international collaborative action. PLOS Medicine. 14 (7), 1002344 (2017).
  10. Singh, S., Singh, S. K., Chowdhury, I., Singh, R. Understanding the Mechanism of Bacterial Biofilms Resistance to Antimicrobial Agents. Open Microbiology Journal. 11, 53-62 (2017).
  11. Greiner, L. L., et al. Biofilm Formation by Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 73 (4), 1964-1970 (2005).
  12. Zollner, R., Oldewurtel, E. R., Kouzel, N., Maier, B. Phase and antigenic variation govern competition dynamics through positioning in bacterial colonies. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
  13. Stein, D. C., et al. Expression of Opacity Proteins Interferes with the Transmigration of Neisseria gonorrhoeae. across Polarized Epithelial Cells. PLoS One. 10 (8), 0134342 (2015).
  14. LeVan, A., et al. Construction and characterization of a derivative of Neisseria gonorrhoeae strain MS11 devoid of all opa genes. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6468-6478 (2012).
  15. Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O’Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Curr Protoc Microbiol. , (2005).
  16. Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
  17. White, L. A., Kellogg, D. S. Neisseria Gonorrhoeae Identification in Direct Smears by a Fluorescent Antibody-Counterstain Method. Journal of Applied Microbiology. 13, 171-174 (1965).
  18. Swanson, J., Kraus, S. J., Gotschlich, E. C. Studies on gonococcus infection. I. Pili and zones of adhesion: their relation to gonococcal growth patterns. Journal of Experimental Medicine. 134 (4), 886-906 (1971).
  19. Herten, M., et al. Rapid in Vitro Quantification of S. aureus Biofilms on Vascular Graft Surfaces. Frontiers in Microbiology. 8, 2333 (2017).
  20. Gracia, E., et al. In vitro development of Staphylococcus aureus biofilms using slime-producing variants and ATP-bioluminescence for automated bacterial quantification. Luminescence. 14 (1), 23-31 (1999).
  21. Webb, J. S., et al. Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Journal of Bacteriology. 185 (15), 4585-4592 (2003).
  22. Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide. Journal of visualized experiments. (47), (2011).
  23. Wang, L. C., Litwin, M., Sahiholnasab, Z., Song, W., Stein, D. C. Neisseria gonorrhoeae Aggregation Reduces Its Ceftriaxone Susceptibility. Antibiotics (Basel). 7 (2), (2018).
  24. Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 510-543 (2014).
  25. Hall-Stoodley, L., et al. Towards diagnostic guidelines for biofilm-associated infections. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 127-145 (2012).

Play Video

Cite This Article
Wang, L., Wagner, J., Capino, A., Nesbit, E., Song, W., Stein, D. C. Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining. J. Vis. Exp. (144), e58978, doi:10.3791/58978 (2019).

View Video