यहां, हम डिजाइन करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद है और तंत्रिका विकास कारक (NGF) के लिए क्षरण वाहक के रूप में नैनोसंरचित असुरक्षित सिलिकॉन (साई) फिल्मों बनाना । PC12 कोशिकाओं और चूहों पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रंथि (डीआरजी) न्यूरॉन्स के ंयूरॉन भेदभाव और वृद्धि NGF भरी साई वाहक के साथ इलाज पर विशेषता है.
neurodegenerative रोगों के इलाज के लिए NGF की महान क्षमता के बावजूद, अपने चिकित्सीय प्रशासन एक महत्वपूर्ण चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है के रूप में प्रोटीन रक्त मस्तिष्क बाधा पार नहीं है, इसके रासायनिक गुणों के कारण, और इस तरह लंबी अवधि की आवश्यकता है मस्तिष्क को प्रसव के लिए एक जैविक प्रभाव है । यह काम इस संवेदनशील प्रोटीन के निरंतर वितरण के लिए NGF के क्षरण वाहक के रूप में नैनोसंरचित साई फिल्मों के निर्माण का वर्णन है । साई वाहक विशेष रूप से अपनी जैविक गतिविधि के संरक्षण, जबकि चार सप्ताह की अवधि के लिए उच्च लदान प्रभावकारिता और NGF की लगातार रिहाई प्राप्त करने के लिए सिलवाया रहे हैं । एक NGF वितरण प्रणाली के रूप में NGF-साई वाहक के व्यवहार को न्यूरॉन्स और PC12 कोशिकाओं और असंबद्ध डीआरजी ंयूरॉंस की वृद्धि के लिए प्रेरित करने के लिए उनकी क्षमता का परीक्षण करके इन विट्रो में जांच की है । स्वच्छ और NGF भरी साई वाहकों की उपस्थिति में सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन किया है । NGF के साई वाहकों से जारी की गैर गतिविधि दोहराए मुक्त NGF प्रशासन के पारंपरिक उपचार की तुलना में है । PC12 कोशिका विभेद का विश्लेषण और विभेदित कोशिकाओं के तीन अलग रूपात्मक मापदंडों की माप द्वारा विशेषता है; (i) सोमार से neurites निकालने की संख्या (ii) कुल neurites ‘ लंबाई और (iii) बंटी हुई अंकों की संख्या. PC12 कोशिकाओं NGF-साई वाहकों के साथ इलाज जारी अवधि के दौरान एक गहरा भेदभाव का प्रदर्शन । इसके अलावा, डीआरजी ंयूरॉन कोशिकाओं NGF-साई वाहकों के साथ प्रसंस्कृत एक व्यापक neurite दीक्षा दिखाने के लिए, के समान ंयूरॉंस दोहराए मुफ्त NGF प्रशासन के साथ इलाज किया । अध्ययन स्वरित्र वाहकों neurodegenerative रोगों के लिए एक चिकित्सीय क्षमता के साथ NGF रिहाई के लिए दीर्घकालिक प्रत्यारोपण प्रदर्शित करता है ।
NGF परिधीय तंत्रिका तंत्र में न्यूरॉन्स के विकास और रखरखाव के लिए आवश्यक है (पीएन)1 और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस)2में अस्तित्व और बेसल forebrain कोलीनर्जिक न्यूरॉन्स के समारोह में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. इस तरह के अल्जाइमर और पार्किंसंस के रूप में केंद्रीय neurodegenerative रोगों के इलाज के लिए उच्च औषधीय क्षमता, व्यापक रूप से प्रदर्शन किया गया है, नैदानिक परीक्षण के साथ वर्तमान में प्रगति3,4,5, 6. सीएनएस के लिए NGF के वितरण में सबसे बड़ी चुनौती अपने रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB), जब प्रणालीबद्ध प्रशासित7पार करने में असमर्थता में रहता है । इसके अलावा, NGF संवेदनशीलता तेजी से एंजाइमी गिरावट को अपने छोटे आधे जीवन renders और काफी अपनी चिकित्सीय उपयोग सीमा8,9। इसलिए, वहां एक unmet के लिए वितरण प्रणाली है जो एक सुरक्षित तरीके से NGF के एक लंबे समय तक और नियंत्रित रिलीज के लिए अनुमति डिजाइन चुनौती है । विभिन्न NGF वितरण प्रणालियों, जिनमें बहुलक आधारित प्रणालियों का अध्ययन किया गया है,10,11,12,13,14,15, 16 , 17. इन प्रणालियों के रिलीज प्रोफाइल अक्सर एक अलग प्रारंभिक एक धीमी गति से जारी है, जहां बाद के चरण में रिलीज दर प्रारंभिक फट11 की तुलना में काफी कम था द्वारा पीछा किया फट द्वारा विशेषता थे ,18,19. इसके अलावा, पॉलिमर के अम्लीय क्षरण उत्पादों द्वारा प्रोटीन की निष्क्रियता (जैसे, पाली (लैक्टिक-co-glycolic) एसिड) या encapsulation प्रक्रिया के दौरान NGF के नुकसान की कमी इस20प्रणालियों के साथ मनाया गया ।
नैनोसंरचित साई कई अपील गुणों की विशेषता है, इसकी उच्च सतह क्षेत्र सहित, बड़े छिद्रित मात्रा, असंगति, और शारीरिक तरल पदार्थ में स्वरित्र क्षरण, यह एक होनहार दवा वितरण मंच21के लिए पूर्वनिर्धारित, 22,23,24,25,26,27,28। अपनी यांग की स्थिति के उचित चयन के लिए आसानी से साई संरचनात्मक गुणों को समायोजित करने की अनुमति देता है (जैसे, porosity और ताकना आकार) दवा लदान और रिलीज कैनेटीक्स21,27सिलाई के लिए । इसके अलावा, विभिंन सुविधाजनक रासायनिक मार्गों के लिए साई की सतह को संशोधित करने की अनुमति और आगे की धुन शारीरिक स्थितियों के तहत एसआई पाड़ के विघटन दर और22,24दवा की रिहाई दर, २९,३०.
यह काम NGF के लंबे समय तक नियंत्रित रिहाई के लिए एक साई आधारित वितरण प्रणाली डिजाइनिंग पर केंद्रित है । NGF-साई वाहकों के प्रभाव में न्यूरॉन्स और वृद्धि पर PC12 कोशिकाओं और असंबद्ध डीआरजी न्यूरॉन्स का उपयोग कर की जांच की है. हम प्रदर्शित करते है कि भरी हुई NGF एक एक प्रशासन के भीतर एक 1 महीने के रिलीज की अवधि के दौरान neurite वृद्धि और गहरा भेदभाव उत्प्रेरण द्वारा अपनी गतिविधियों को बनाए रखा है ।
ह्रास नैनोसंरचित PSiO2 फिल्में गढ़े और NGF के लिए वाहक के रूप में कार्यरत हैं, इसकी सतत और लंबे समय तक जारी करने के लिए अनुमति देता है, whilst अपनी जैविक गतिविधि को बनाए रखने । PSiO2 की क्षमता NGF के लिए एक वितरण प्रणाली के रूप में सेवा करने के लिए पर्याप्त NGF खुराक के लिए न्यूरॉन विभेद पैदा करने और PC12 कोशिकाओं और डीआरजी न्यूरॉन्स की वृद्धि को बढ़ावा देने के लिए जारी करने की क्षमता का प्रदर्शन करके इन विट्रो में प्रदर्शन किया है. इंजीनियर फिल्मों vivo मेंभविष्य के इलाज के लिए NGF के दीर्घकालिक जलाशयों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
गढ़े साई फिल्मों के संरचनात्मक गुण विशेष रूप से NGF पेलोड के लिए सिलवाया रहे थे; विद्युत नक़्क़ाशी प्रक्रिया के वर्तमान घनत्व के लिए लगभग ४० एनएम कि आसानी से NGF, २६.५ केडीए३२ के एक आणविक वजन के साथ एक प्रोटीन को समायोजित करेगा और ~ 4 एनएम३३की एक विशेषता व्यास के ताकना आकार प्राप्त करने के लिए समायोजित किया गया था, भीतर छिद्रित मैट्रिक्स । इसके अलावा, असुरक्षित पाड़ के थर्मल ऑक्सीकरण नकारात्मक आरोप लगाया ऑक्सीकरण साई की सतह के लिए सकारात्मक आरोप लगाया प्रोटीन के इलेक्ट्रोस्टैटिक आकर्षण द्वारा NGF के शारीरिक सोखना सक्षम करने के लिए प्रदर्शन किया गया था । साई की सतह रसायन लोड हो रहा है प्रभावकारिता पर एक बड़ा प्रभाव डालती है और आसानी से करने के लिए बेहतर पेलोड और छिद्रित मैट्रिक्स के बीच बातचीत को नियंत्रित करने के लिए देखते हो सकता है । इन बातचीत के बाद adsorbed प्रोटीन अणुओं की संरचना हुक्म और उनके३४,३५,३६। अंत में, प्रणाली को ध्यान से उपयुक्त ताकना आकार, सतह विशेषताओं और आदर्श लोडिंग विलायक और उल्लेख किया मापदंडों के परिणामस्वरूप प्रभाव का चयन करके NGF के इष्टतम लदान प्राप्त करने के लिए समायोजित किया गया था प्रोटीन लोडिंग हुक्म प्रभावकारिता. इसलिए, निर्माण मापदंडों में कोई परिवर्तन (जैसे, वर्तमान घनत्व, नक़्क़ाशी समय, प्रकार और dopant या इलेक्ट्रोलाइट की एकाग्रता), सतह रसायन विज्ञान या लोड समाधान संरचना लदान प्रभावकारिता और जैव गतिविधि को प्रभावित कर सकते हैं लोड प्रोटीन ।
साई orPSiO2मेजबान से एक पेलोड के रिलीज दर आम तौर पर दो एक साथ तंत्र का एक संयोजन, बाहर पेलोड अणुओं के प्रसार और Si पाड़३७के क्षरण द्वारा तय है । कटाव और बाद में विघटन दर आरोपण स्थल, उसकी विकृति और रोग राज्य28,३८,३९से प्रभावित हैं । यह पिछले काम में स्थापित किया गया था कि अगर एक अलग रिलीज दर एक निश्चित चिकित्सकीय आवेदन के लिए आवश्यक है, रिलीज प्रोफ़ाइल और संशोधित किया जा सकता है साई की सतह३८,४०की सतह रसायन विज्ञान बदल कर लंबे समय तक, ४१. इस तरह के थर्मल ऑक्सीकरण, थर्मल जलकर और hydrosilylation तकनीक के रूप में विभिंन रासायनिक संशोधनों, साई की सतह को स्थिर और इसके क्षरण और फलस्वरूप पेलोड रिलीज३५,४२ को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है ,४३,४४,४५. इसके अलावा, विभिंन सतह रसायन शास्त्र मार्गों के माध्यम से एसआई पाड़ को प्रोटीन अणुओं के आबंध लगाव द्वारा वाहक में NGF की लोडिंग एक अधिक लंबे समय तक जारी है क्योंकि पेलोड ही जारी किया है जब आबंध बांड या टूट रहे है के माध्यम से होना चाहिए सहायक एसआई मैट्रिक्स21अपमानित है ।
इसके अलावा, इसके निर्माण की प्रक्रिया के बाद, साई ऐसी microparticles४६, नैनोकणों४७ या मुक्त खड़े झिल्ली26, जो भी वाहक के रूप में नियोजित किया जा सकता है के रूप में पतली फिल्मों, के अलावा विभिंन विंयास में प्रदान किया जा सकता है NGF के लिए और विशिष्ट आवेदन की जरूरत को पूरा ।
नैदानिक रूप से प्रासंगिक होने के लिए, PSiO2 वाहकों के भीतर NGF सामग्री चिकित्सकीय खुराक की सीमा तक पहुंच जाना चाहिए । प्रोटोकॉल में वर्णित विधि में, NGF-PSiO लोड2 वाहक सेल मीडिया या पंजाबियों बफर के 2 मिलीलीटर की एक सुसंगत मात्रा में पेश कर रहे है और इस प्रकार, लदान समाधान और संबंधित NGF मास लोड की एकाग्रता के लिए एक उपज समायोजित किया गया जारी NGF एकाग्रता है कि इन विट्रो प्रणाली में परीक्षण के लिए प्रासंगिक है । जब विभिंन प्रणालियों के लिए इस विधि का उपयोग, जैसे कि पूर्व vivo या vivo वातावरण में , NGF लोडिंग समाधान की एकाग्रता और वृद्धि की जरूरत खुराक के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए । वैकल्पिक रूप से, उच्च NGF सामग्री का परीक्षण क्षेत्र के अनुसार या PSiO2 नमूनों के बड़े क्षेत्रों का उपयोग करके कई वाहक शुरू द्वारा प्राप्त किया जा सकता है ।
इसके अलावा, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि रिलीज की अवधि के साथ बाद में समय अंक में, जारी NGF सांद्रता पहले के समय अंक की तुलना में बहुत कम हैं । तथ्य यह है कि NGF प्रवाह समय पर स्थिर नहीं है ध्यान में रखा जाना चाहिए जब आवेदन की जरूरत के अनुसार प्रणाली डिजाइनिंग ।
कई NGF वितरण प्रणालियों विकसित किया गया है और साहित्य में रिपोर्ट, उनमें से ज्यादातर बहुलक आधारित प्रणालियों रहे हैं, सिंथेटिक या प्राकृतिक बहुलक conjugates के शामिल10,11,12,15 , 16 , 17. इन प्रणालियों प्रभावी निरंतर रिलीज प्रोफाइल दिखाया है, तथापि, रिलीज की अवधि के एक महत्वपूर्ण फट प्रभाव के साथ कई दिनों की अवधि में फैले । इन वितरण प्लेटफार्मों के कुछ इस तरह के encapsulation प्रक्रिया पर गैर गतिविधि के नुकसान के रूप में महत्वपूर्ण सीमाओं से ग्रस्त हैं, अलग स्थिर एजेंटों18,४८के उपयोग की आवश्यकता है, साथ ही परिष्कृत और जटिल निर्माण तकनीक16। प्रोटीन के लिए वितरण प्रणालियों को डिजाइन करने में सबसे बड़ी चुनौतियों में से एक वाहक प्रणाली के भीतर फंसाने पर अणुओं की गतिविधियों को बनाए रखने की क्षमता है । प्रोटीन या पेप्टाइड्स PSiO2 RT पर या यहां तक कि कम तापमान पर मजबूत कार्बनिक सॉल्वैंट्स, जो दोनों महत्वपूर्ण कारक है जब इन संवेदनशील जैव अणुओं लोड हो रहा है का उपयोग कर के बिना लोड किया जा सकता है । पिछले अध्ययनों का प्रदर्शन किया है कि साई/PSiO2 भूतल रसायन विज्ञान३५,३६भरी हुई प्रोटीन की संभव विकार को कम करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । इसलिए, PSi/PSiO2 सामान्य और विशेष रूप से NGF में वृद्धि कारकों के लिए वितरण प्रणालियों के विकास के लिए एक लाभप्रद nanomaterial है ।
वर्तमान काम neurodegenerative रोगों के संभावित उपचार के लिए सीएनएस में NGF के प्रत्यक्ष प्रशासन के लिए एक नया चिकित्सकीय दृष्टिकोण के रूप में इस विधि के उपयोग पर ध्यान केंद्रित किया है । NGF-लोडेड PSiO2 वाहकों को चूहों के दिमाग में प्रत्यारोपित किया जा सकता है और लंबे समय तक प्रत्यारोपण के रूप में प्लेटफार्म की प्रभावकारिता वीवो मेंपढ़ाई जाती है । इसके अलावा, गैर इनवेसिव biolistics४९,५० के साथ इस होनहार वाहकों के संयोजन के लिए एक NGF-लोड PSiO2 एक स्थानीयकृत क्षेत्र के लिए एक उच्च स्थानिक संकल्प में कणों के एक उपंयास वायवीय का उपयोग कर प्रशासन को सक्षम कर सकते है neurodegenerative विकारों के इलाज के लिए केशिका बंदूक, जहां एक spatiotemporal दवा प्रशासन की आवश्यकता है । इसके अलावा, NGF एक रासायनिक ढाल तरीके५१, axon मार्गदर्शन अणुओं के समान में ंयूरॉन विकास प्रत्यक्ष कर सकते हैं । इस प्रकार, लोड PSiO2 वाहक NGF के लिए आकर्षित गर्म स्थानों के रूप में सेवा कर सकते हैं, प्रत्यक्ष विकास के लिए, अंय निर्देशन cues५२,५३के लिए पूरक । इसके अलावा, PSiO2वाहक विशेष रूप से आगे ट्यूनिंग PSiO2 nanostructure और इसकी सतह रसायन विज्ञान द्वारा कई महीनों तक की एक बहुत विस्तारित समय अवधि के लिए NGF की डिलीवरी बनाए रखने के लिए सिलवाया जा सकता है ।
The authors have nothing to disclose.
एमएस और ES कोर सेवाओं और लॉरी मैं जीवन विज्ञान और इंजीनियरिंग और रसेल Berrie नैनो संस्थान के Technion में वित्तीय सहायता के लिए Lokey केंद्र से समर्थन स्वीकार करते हैं ।
Acetone | Gadot | 830101375 | |
Amphotericin | Biological Industries | 03-028-1B | |
Aqueous HF (48%) | Merck | 101513 | |
AZ4533 photoresist | Metal Chem, Inc. | AZ4533 | |
BSA fraction v | MP biomedicals | 0216006950 | |
BSA solution (10%) | Biological Industries | 03-010-1B | |
Collagen type l | Corning Inc. | 354236 | |
Collagenase | Enco | LS004176 | |
Collagen-coated plastic coverslips | NUNC Thermanox | 1059846 | |
D-(+)-glucose | Sigma-Aldrich Chemicals | G8170 | |
Dispase-II | Sigma-Aldrich Chemicals | 4942078001 | |
Donkey anti mouse IgG H&L conjugated Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150073 | |
Ethanol absolute (99.9%) | Merck | 818760 | |
FBS | Biological Industries | 04-121-1A | |
Formaldehyde/glutaraldehyde (2.5%) in 0.1 M sodium cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 15949 | |
Freon | Sigma-Aldrich Chemicals | 613894 | |
Guanidine-HCl | Sigma-Aldrich Chemicals | G7294 | |
Ham's F-12 nutrient mixture | Thermo Scientific | 11765054 | |
HBSS | Thermo Scientific | 14185-045 | |
HEPES (1M) | Thermo Scientific | 15630-056 | |
HS | Biological Industries | 04-124-1A | |
Human β-NGF ELISA Development Kit | Peprotech | 900-K60 | |
Immumount solution | Thermo Scientific | 9990402 | |
L-15 medium | Sigma-Aldrich Chemicals | L5520 | |
Laminin | Thermo Scientific | 23017015 | |
L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1A | |
Mouse anti neurofilament H (NF-H) (phosphorylated antibody) antibody | BiolLegend | SMI31P | |
Murine β-NGF | Peprotech | 450-34-20 | |
Normal donkey serum (NDS) | Sigma-Aldrich Chemicals | G9023 | |
Papain | Sigma-Aldrich Chemicals | p-4762 | |
Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | BN15710 | |
PBS (pH 7.4) | prepared by dissolving 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl and 2.7 mM KCl in double-distilled water (ddH2O, 18 MΩ). |
||
PBS X10 | Biological Industries | 02-020-1A | |
PC12 cell line | ATCC | CRL-1721 | |
Penicillin–streptomycin | Biological Industries | 03-032-1B | |
Percoll | Sigma-Aldrich Chemicals | p1644 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich Chemicals | P4832 | |
PrestoBlue reagent | Thermo Scientific | A13261 | |
RPMI medium | Biological Industries | 01-100-1A | |
Si wafer | Siltronix Corp. | Highly-B-doped, p-type, 0.00095 Ω-cm resistivity, <100> oriented | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich Chemicals | S2002 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich Chemicals | S8045 | |
Tannic acid | Sigma-Aldrich Chemicals | 403040 | |
Triton X-100 | Chem-Impex International Inc. | 1279 |