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생물학

Spatio-लौकिक मानचित्रण और कण विश्लेषण तकनीक के अनुप्रयोगों Intracellular Ca के लिए2 + सीटू में संकेतन

Published: January 07, 2019
doi:
10.3791/58989
, , ,
1Department of Physiology and Cell Biology,University of Nevada Reno School of Medicine, 2Department of Pharmacology, The Robert Larner, M.D. College of Medicine,University of Vermont

Summary

आनुवंशिक रूप से एंकोडेड ca2 + संकेतक (GECIs) मौलिक कैसे सीटू Ca2 + इमेजिंग किया जाता है में बदल गया है । इस तरह की रिकॉर्डिंग से डेटा वसूली को अधिकतम करने के लिए, Ca के उपयुक्त विश्लेषण2 + संकेतों की आवश्यकता है । इस पेपर में प्रोटोकॉल spatiotemporal मानचित्रण और कण आधारित विश्लेषण का उपयोग कर सीटू में दर्ज सीए2 + संकेतों के ठहराव की सुविधा ।

Abstract

ca2 + पृथक कोशिकाओं या बरकरार ऊतकों के भीतर कोशिकाओं के विशिष्ट प्रकार के इमेजिंग अक्सर सीए2 + संकेत के जटिल पैटर्न से पता चलता है । इस गतिविधि में सावधानी और गहराई से विश्लेषण और संभव के रूप में अंतर्निहित घटनाओं के बारे में अधिक जानकारी के रूप में कैप्चर करने के लिए ठहराव की आवश्यकता है । स्थानिक, लौकिक और तीव्रता पैरामीटर सीए के लिए आंतरिक2 + आवृत्ति, अवधि, प्रसार, वेग और आयाम के रूप में संकेत कुछ जैविक intracellular संकेत के लिए आवश्यक जानकारी प्रदान कर सकते हैं । उच्च-रिज़ॉल्यूशन Ca2 + इमेजिंग आमतौर पर quantifiable डेटा में इमेजिंग जानकारी का अनुवाद करने के मामले में प्रक्रिया करने के लिए समय लेने वाले बड़े डेटा फ़ाइलों के अधिग्रहण में परिणाम, और इस प्रक्रिया को मानव त्रुटि और पूर्वाग्रह के लिए अतिसंवेदनशील हो सकते हैं । 2 सीए का विश्लेषण+ सीटू में कोशिकाओं से संकेत आम तौर पर (FOV) देखने के एक क्षेत्र के भीतर ब्याज की मनमाने ढंग से चयनित क्षेत्रों (रॉय) से सरल तीव्रता माप पर निर्भर करता है. इस दृष्टिकोण बहुत महत्वपूर्ण संकेतन FOV में निहित जानकारी की अनदेखी । इस प्रकार, ca 2 + रंजक या optogenetic ca2 + इमेजिंग, उचित स्थानिक और अस्थाई विश्लेषणके साथ प्राप्त की ऐसी उच्च संकल्प रिकॉर्डिंग से जानकारी की वसूली को अधिकतम करने के लिए 2 + संकेतों की आवश्यकता है । इस पत्र में उल्लिखित प्रोटोकॉल का वर्णन करेगा कि कैसे डेटा की एक उच्च मात्रा ca से प्राप्त किया जा सकता2 + इमेजिंग रिकॉर्डिंग और अधिक पूर्ण विश्लेषण की सुविधा के लिए और ca के ठहराव2 + संकेतों का एक संयोजन का उपयोग कर कोशिकाओं से रिकॉर्ड की गई spatiotemporal मानचित्र (STM)-आधारित विश्लेषण और कण आधारित विश्लेषण । प्रोटोकॉल भी वर्णन कैसे विभिंन पैटर्न Ca के2 + संकेत सीटू में अलग सेल की आबादी में मनाया उचित विश्लेषण किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, विधि 2 सीए की जांच करेगा+ छोटी आंत में कोशिकाओं की एक विशेष जनसंख्या में संकेतन, Cajal के मध्यवर्ती कोशिकाओं (आईसीसी), GECIs का उपयोग कर.

Introduction

Ca2 + एक सर्वव्यापी intracellular दूत जो सेलुलर प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला जैसे मांसपेशियों संकुचन1,2, चयापचय3, सेल प्रसार3,4, नियंत्रण है 5, तंत्रिका टर्मिनलों6,7, और नाभिक में प्रतिलेखन कारकों के सक्रियकरण पर न्यूरोट्रांसमीटर रिहाई की उत्तेजना । 7 Intracellular ca2 + संकेतों अक्सर cytosolic Ca2 +में क्षणिक उंनयन के रूप ले, और इन सहज हो सकता है या एगोनिस्ट उत्तेजना से उत्पंन सेल प्रकार8के आधार पर । स्थानिक, लौकिक और तीव्रता पैरामीटर सीए 2 के लिए आंतरिक+ आवृत्ति, अवधि, प्रसार, वेग के रूप में संकेत है, और आयाम जैविक intracellular संकेत5के लिए आवश्यक जानकारी प्रदान कर सकते हैं, 7 , 9. Cytoplasmic ca 2+ सिग्नल ca के आमद से परिणाम कर सकते हैं2 + extracellular अंतरिक्ष से या ca के माध्यम से 2 + रिलीज endoplasmic जालिका (एर) से ca के माध्यम से2 + रिलीज चैनलों ऐसे ryanodine रिसेप्टर्स के रूप में (RyRs) और inositol-त्रिकोणीय फॉस्फेट रिसेप्टर्स (आईपी3रुपये)10. RyRs और आईपी3रुपये दोनों सीए की पीढ़ी के लिए योगदान कर सकते हैं2 + संकेतों और इन चैनलों, जो विभिन्न सीए2 + आमद तंत्र के साथ संयुक्त के साथ संयोजित एक सीए के असंख्य में परिणाम कर सकते हैं2 + संकेत पैटर्न जो संख्या और ca2 + आमद चैनल की ओपन प्रायिकता के आकार के होते हैं, ca 2 + रिलीज़ चैनलों की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल, ca2 + आमद और रिलीज़ चैनलों के बीच निकटता, और अभिव्यक्ति और ca 2 के वितरण + reuptake और बाहर निकालना प्रोटीन । ca2 + संकेतों वर्दी, लंबे समय तक चलने, उच्च तीव्रता वैश्विक दोलनों कि कई सेकंड या यहां तक कि मिनट के लिए पिछले हो सकता है के रूप ले सकते हैं, intracellular और सेलुलर सीए2 + तरंगों है कि intracellular दूरी पार कर सकते है प्रचार अधिक १०० µm10,11,12,13,14,15,16, या अधिक संक्षिप्त, विशेष रूप से स्थानीयकृत इवेंट जैसे Ca2 + स्पार्क्स और2 Ca + puffs कि मिलीसेकंड timescales के दसियों पर होते है और कम 5 µm17,18,19,20से फैल ।

फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है Ca2 + अलग और प्रसंस्कृत कोशिकाओं में संकेत और बरकरार ऊतकों में निगरानी । परंपरागत रूप से, इन प्रयोगों फ्लोरोसेंट सीए 2 का उपयोग शामिल+ संकेतक, ratiometric और गैर ratiometric रंजक जैसे Fura2, Fluo3/4 या Rhod2, दूसरों के बीच में 21,22,23. ये संकेतक कोशिका झिल्ली को पारगंय और फिर अंतर्जात esterases के माध्यम से एक एस्टर समूह की दरार द्वारा कोशिकाओं में फंस बनने के लिए डिजाइन किए गए थे । 2 Ca के बंधन+ उच्च संबध संकेतक के लिए प्रतिदीप्ति में परिवर्तन के कारण जब कोशिकाओं और ऊतकों प्रकाश की उचित तरंग दैर्ध्य द्वारा प्रबुद्ध थे । सेल पारगंय ca के उपयोग2 + संकेतक बहुत सीए की हमारी समझ को बढ़ाया2 + जीवित कोशिकाओं में संकेत और स्थानिक संकल्प और इन संकेतों है कि Ca2 + सिग्नल परख द्वारा संभव नहीं था की अनुमति दी ठहराव अंय साधनों के माध्यम से, जैसे इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी । हालांकि, पारंपरिक Ca2 + संकेतक है कई सीमाएं, जैसे विस्तारित रिकॉर्डिंग अवधियों पर24photobleaching होती है । जबकि नए ca2 + सूचक Cal520/590 के रूप में रंजक बहुत शोर अनुपात करने के लिए संकेत में सुधार हुआ है और स्थानीय Ca का पता लगाने की क्षमता2 + सिग्नल25, photobleaching के साथ मुद्दों अभी भी कुछ जांचकर्ताओं के लिए एक चिंता का विषय रह सकते हैं २६,२७,२८. तेज़ photobleaching भी बढ़ाई, छवि अधिग्रहण की दर को प्रतिबंधित करता है, और संकल्प है कि रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में वृद्धि की उद्देश्य शक्ति और छवि अधिग्रहण की उच्च दर वृद्धि हुई उत्तेजना प्रकाश तीव्रता की आवश्यकता है कि बढ़ता photobleaching ।

intracellular ca2 + संकेतों बरकरार ऊतकों से रिकॉर्डिंग जब उदाहरण के लिए, सीटू में सीए2 + संकेतों रिकॉर्डिंग जब पारंपरिक ca2 + संकेतक रंजक की इन सीमाओं को ख़राब कर रहे हैं । इसके बाद के संस्करण की समस्याओं के लिए, ca के दृश्य2 + सीटू में संकेतों सेल पारगंय सीए का उपयोग कर2 + संकेतक कम बिजली आवर्धन और छवि पर कब्जा की कम दरों तक सीमित किया गया है, जांचकर्ताओं की क्षमता को रिकॉर्ड करने के लिए विवश और अस्थायी या स्थानिक रूप से प्रतिबंधित उपसेलुलर सीए2 + संकेतों को बढ़ाता है । इस प्रकार, यह गया है मुश्किल पर कब्जा करने के लिए, विश्लेषण, और सीए 2 के स्थानिक और लौकिक जटिलता+ संकेतों की सराहना करते हैं, जो वांछित जैविक प्रतिक्रियाओं की पीढ़ी में महत्वपूर्ण हो सकता है, के रूप में ऊपर उल्लिखित । 2 सीए का विश्लेषण+ सीटू में कोशिकाओं से संकेत आम तौर पर (FOV) देखने के एक क्षेत्र के भीतर ब्याज के चयनित क्षेत्रों (रॉय) से सरल तीव्रता माप पर निर्भर करता है. संख्या, आकार और ROIs की स्थिति की मनमानी पसंद, शोधकर्ता की सनक पर निर्भर है, गंभीर रूप से प्राप्त परिणामों पूर्वाग्रह कर सकते हैं । के रूप में अच्छी तरह के रूप में रॉय विश्लेषण के साथ निहित पूर्वाग्रह, इस दृष्टिकोण महत्वपूर्ण संकेतन FOV में निहित जानकारी के बहुत उपेक्षा, गतिशील Ca के रूप में2 + एक मनमाने ढंग से चुना रॉय के भीतर घटनाओं विश्लेषण के लिए चुना जाता है । इसके अलावा, ROIs के विश्लेषण के लिए Ca के स्थानिक विशेषताओं के बारे में जानकारी प्रदान करने में विफल रहता है2 + मनाया संकेतों । उदाहरण के लिए, यह हो सकता है नहीं संभव हो ca 2 + में एक वृद्धि के बीच अंतर करने के लिए + परिणामस्वरूप एक प्रोपेगेटिंग ca2 + लहर और एक अत्यधिक स्थानीयकृत ca 2 + रिलीज़ इवेंट से tabulations ca2 + एक ROI के भीतर संकेतों ।

आनुवंशिक रूप से एनकोडेड ca केआगमन 2 + संकेतक (GECIs) मौलिक बदल गया है कैसे ca2 + इमेजिंग सीटू मेंकिया जा सकता है29,30,31,३२,३३ . रंगों से अधिक GECIs का उपयोग करने के लिए कई फायदे हैं । सबसे महत्वपूर्ण शायद यह है कि GECI की अभिव्यक्ति एक सेल विशिष्ट तरीके से किया जा सकता है, जो नहीं ब्याज की कोशिकाओं से अवांछित पृष्ठभूमि संदूषण कम कर देता है । पारंपरिक Ca 2 पर GECIs का एक और लाभ+ संकेतक यह है कि photobleaching कम है (के रूप में प्रतिदीप्ति और परिणामी photobleaching केवल तब होती है जब कोशिकाओं को सक्रिय कर रहे हैं), के रूप में डाई से भरा नमूनों की तुलना में, विशेष रूप से उच्च पर आवर्धन और छवि की ऊंची दरों पर कब्जा३४। इस प्रकार, GECIs के साथ इमेजिंग, ऐसे optogenetic सेंसर की GCaMP श्रृंखला के रूप में, मुलाजिम के लिए संक्षिप्त रिकॉर्ड करने की क्षमता, स्थानीय उप सेलुलर सीए2 + सीटू में सिग्नल और जांच ca2 + कोशिकाओं में अपने भीतर संकेतन मूल वातावरण है कि पहले से संभव नहीं किया गया है । इस तरह के उच्च संकल्प रिकॉर्डिंग से जानकारी की वसूली को अधिकतम करने के लिए, उपयुक्त स्थानिक और अस्थायी विश्लेषण के Ca2 + संकेतों की आवश्यकता है. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि जबकि GECIs कुछ स्पष्ट लाभ की पेशकश कर सकते हैं, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि सीए2 + इमेजिंग सफलतापूर्वक एक साथ पारंपरिक का उपयोग कर ंयूरॉंस के विभिंन neurochemical वर्गों की बड़ी आबादी से प्रदर्शन किया जा सकता है Ca2 + संकेतक कि आनुवंशिक रूप से पशु३५में एनकोडेड नहीं हैं । इस दृष्टिकोण के बाद हॉक immunohistochemistry सिंक्रनाइज़ फटने में उच्च आवृत्ति पर फायरिंग न्यूरॉन्स के कई विभिन्न वर्गों प्रकट करने के लिए इस्तेमाल किया, और संभावित है कि पशु के लिए आनुवंशिक संशोधनों शारीरिक के साथ हस्तक्षेप किया है हो सकता से परहेज व्यवहार जांचकर्ता३५,३६समझ चाहता है ।

इस पत्र में उल्लिखित प्रोटोकॉल और अधिक पूर्ण विश्लेषण और सीए के ठहराव2 + spatiotemporal मानचित्र (STM) आधारित विश्लेषण और कण आधारित विश्लेषण का एक संयोजन का उपयोग कर सीटू में कक्षों से रिकॉर्ड किए गए संकेतों की सुविधा । प्रोटोकॉल भी वर्णन कैसे विभिंन पैटर्न Ca के2 + संकेत सीटू में अलग सेल की आबादी में मनाया उचित विश्लेषण किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, विधि छोटी आंत में कोशिकाओं की एक विशेष जनसंख्या में सीए2 + संकेत की जांच करेगा, Cajal (आईसीसी) के मध्यवर्ती कोशिकाओं. आईसीसी GCaMPs३७,३८,३९,४०व्यक्त चूहों का उपयोग visualized के रूप में, गतिशील intracellular सीए2 + संकेतन प्रदर्शन, जठरांत्र (सैनिक) पथ में विशिष्ट कोशिकाओं रहे हैं ४१,४२. 2 सीए + आईसीसी में यात्रियों के सक्रियण से जुड़े रहे हैं ca2 +-सक्रिय Cl– चैनल ( Ano1द्वारा इनकोडिंग) कि आंतों चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (SMCs)४३की उत्तेजितता को विनियमित करने में महत्वपूर्ण हैं, ४४,४५. इस प्रकार, Ca के अध्ययन2 + आईसीसी में संकेतन आंत्र गतिशीलता को समझने के लिए मौलिक है. murine छोटी आंत इस प्रदर्शन के लिए एक उत्कृष्ट उदाहरण प्रदान करता है, के रूप में वहां आईसीसी के दो वर्गों है कि anatomically अलग कर रहे है और स्वतंत्र रूप से visualized किया जा सकता है: i) आईसीसी परिपत्र और अनुदैर्ध्य के बीच क्षेत्र में स्थित है चिकनी मांसपेशी परतें, myenteric जाल आसपास (आईसीसी-मेरा) । इन कोशिकाओं पेसमेकर कोशिकाओं के रूप में सेवा और विद्युत धीमी लहरों४६,४७,४८,४९के रूप में जाना जाता गतिविधि उत्पंन; ii) आईसीसी भी मोटर न्यूरॉन्स के टर्मिनलों में अमीर जाल के बीच स्थित हैं (गहरी पेशी जाल, इस प्रकार आईसीसी-DMP). इन कोशिकाओं को प्रवेश मोटर neurotransmission३७,३९,४०,५०के लिए प्रतिक्रियाओं के मध्यस्थों के रूप में सेवा करते हैं । आईसीसी-मेरी और आईसीसी-DMP आकृति विज्ञान अलग हैं, और उनके Ca2 + संकेत व्यवहार मौलिक उनके विशिष्ट कार्यों को पूरा करने के लिए अलग हैं । आईसीसी-मेरे आकार में तारामय है और गैप जंक्शनों५१,५२के माध्यम से परस्पर कोशिकाओं के एक नेटवर्क के रूप में । 2 ca + सिग्नल आईसीसी में-मेरे मैनिफ़ेस्ट संक्षिप्त और स्थानिकी स्थानीयकृत Ca2 + रिलीज़ के रूप में एक से अधिक साइटों में एसिंक्रोनस रूप से आईसीसी के माध्यम से-मेरे नेटवर्क एक FOV के भीतर visualized के रूप में (एक 60X उद्देश्य के साथ imaged)३८. इन अतुल्यकालिक संकेतों अस्थाई 1 दूसरा क्लस्टर में आयोजित कर रहे है कि, जब एक साथ सारणीबद्ध, एक शुद्ध 1 एस सेलुलर वृद्धि में राशि Ca2 +। इन संकेतों को सेल के लिए आईसीसी नेटवर्क के भीतर सेल प्रचार और इसलिए सीए2 + सिग्नलिंग, उप से उत्पंन सेलुलर साइटों, एक ऊतक वाइड Ca2 + वेव में । अस्थाई क्लस्टरिंग और सीए 2 के योग+ आईसीसी में संकेत-मेरे ca2 + क्षणिक क्लस्टर (CTCs)३८का कार्यकाल दिया गया है । CTCs हो rhythmically (उदाहरण के लिए काफी इसी तरह की अवधि और CTCs के बीच समान अवधि) माउस में प्रति मिनट 30 बार । इसके विपरीत, आईसीसी-DMP धुरी आकार कोशिकाओं रहे हैं, माध्यमिक प्रक्रियाओं के साथ कुछ, कि SMCs और वैरिकाज़ तंत्रिका प्रक्रियाओं के बीच वितरित और स्वतंत्र रूप से एक नेटवर्क५१,५२फार्म नहीं है । आईसीसी-DMP फार्म SMCs के साथ अंतर जंक्शनों, तथापि, और इस ग्रेटर syncytium के भीतर समारोह, घूंट syncytium५३के रूप में जाना जाता है । 2 सीए + संकेतों कोशिकाओं की लंबाई के साथ कई साइटों पर होते हैं, लेकिन इन यात्रियों entrained या अस्थायी संकुल नहीं कर रहे हैं, के रूप में आईसीसी में मनाया-मेरे३७. Ca2 + आईसीसी में संकेत-DMP चर तीव्रता, अवधि और स्थानिक विशेषताओं के साथ, एक stochastic तरीके से होते हैं । नीचे दिए गए प्रोटोकॉल, 2 Ca के उदाहरण का उपयोग कर+ आईसीसी में संकेतन-मेरे और आईसीसी-DMP, तकनीक का वर्णन करने के लिए सीटू में कोशिकाओं के विशिष्ट प्रकार में संकेत जटिल विश्लेषण । हम inducible Cre-लोक्स पी प्रणाली का उपयोग आईसीसी में विशेष रूप से GCaMP6f व्यक्त करने के लिए, Cre-Recombinase (Cre) एक आईसीसी विशिष्ट प्रमोटर (किट) से प्रेरित के सक्रियकरण उत्प्रेरण के बाद ।

Protocol

सभी जानवरों का इस्तेमाल किया और इस अध्ययन में किए गए प्रोटोकॉल की देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए स्वास्थ्य गाइड के राष्ट्रीय संस्थानों के साथ अनुसार थे । सभी प्रक्रियाओं को नेवादा, रेनो वि…

Representative Results

किट का प्रयोग-Cre-GCaMP6F चूहों (चित्रा 1), गतिशील Ca2 + आईसीसी के जठरांत्र संबंधी मार्ग में संकेत व्यवहार सीटू में imaged किया जा सकता है. के साथ फोकल माइक्रोस्कोपी, आईसीसी के विशिष्ट आबादी…

Discussion

ca2 + बरकरार ऊतकों के भीतर या कोशिकाओं के नेटवर्क के भीतर कोशिकाओं के विशिष्ट प्रकार के इमेजिंग अक्सर सीए2 + यात्रियों के जटिल पैटर्न से पता चलता है । इस गतिविधि के लिए सावधान और गहराई से विश्लेषण क…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

NIDDK द्वारा P01 DK41315 के माध्यम से धन प्रदान किया गया ।

Materials

Image J software NIH 1.5a Image J software
Volumetry GWH Volumetry 8Gd Custom made analysis software
Isoflurane Baxter, Deerfield, IL, USA NDC 10019-360-60
Tamoxifen Sigma T5648
GCaMP6F mice Jackson Laboratory Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D
Kit-Cre mice Gifted From Dr. Dieter Saur c-Kit+/Cre-ERT2
Ethanol Pharmco-Aaper SDA 2B-6
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Drumm, B. T., Hennig, G. W., Baker, S. A., Sanders, K. M. Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ. J. Vis. Exp. (143), e58989, doi:10.3791/58989 (2019).
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