Immobilisering av levande Caenorhabditis elegans individer med en supertunna Polydimetylsiloxan mikroflödessystem Chip med vätskeretention
Summary
En serie av immobilisering metoder har fastställts för att möjliggöra riktade bestrålning av levande Caenorhabditis elegans individer med hjälp av en nyligen utvecklad ultratunn Polydimetylsiloxan mikroflödessystem chip med vätskeansamling. Denna roman på chip immobilisering är också lämplig för avbildning observationer. För detaljerad behandling och applikationsexempel av chip förklaras.
Abstract
Strålning används ofta för biologiska tillämpningar och för ion-beam avel, och bland dessa metoder, microbeam bestrålning representerar ett kraftfullt medel för att identifiera radiosensitive platser i levande organismer. Detta dokument beskriver en rad på chip immobilisering metoder utvecklats för den riktade microbeam bestrålningen av levande individer av Caenorhabditis elegans. Särskilt, behandling av Polydimetylsiloxan (PDMS) mikroflödessystem chips som vi tidigare utvecklat för att immobilisera C. elegans individer utan behov för anestesi förklaras i detalj. Detta chip, kallad en mask ark, är motståndskraftig att tillåta mikroflödessystem kanalerna utvidgas och elasticitet tillåter djur till inlindas försiktigt. Också, på grund av egen adsorption kapacitet PDMS, djur kan förseglas i kanalerna genom att täcka ytan av bladet mask med en tunn täcka film, där djur inte trycks in kanalerna för kapsling. Genom att vrida locket filmar över, kan vi enkelt samla djuren. Dessutom bladet mask visar vätskeretention och tillåter C. elegans individer att underkastas mikroskopisk observation under långa perioder levande villkor. Bladet är dessutom endast 300 µm tjockt, så att tunga joner såsom koljoner passera bladet omslutande djuren, vilket möjliggör ion partiklarna ska identifieras och tillämpad stråldosen till mätas noggrant. Eftersom val av omslag filmerna används för omslutande djuren är mycket viktig för framgångsrik långsiktig immobilisering, vi genomfört val av lämpligt skydd filmerna och visade en rekommenderade en bland några filmer. Exempelvis tillämpningen av chip infört vi tänkbar observation av muskulära aktiviteter av djur omslutande mikroflödessystem kanalen av bladet mask samt microbeam bestrålning. Dessa exempel visar att masken arken har kraftigt utökade möjligheter för biologiska experiment.
Introduction
Strålning, inklusive röntgen, gammastrålning och tunga-ion beam, används ofta för biologiska applikationer såsom cancerdiagnos och behandling och för ion-beam avel. Många studier och tekniska utvecklingen för närvarande inriktade på effekterna av strålning1,2,3. Microbeam bestrålning är ett kraftfullt medel för att identifiera radiosensitive platser i levande organismer4. Takasaki avancerad strålning institutet av nationella forskningsinstituten för Quantum och radiologiska vetenskap och teknik (QST-Takasaki) har utvecklat en teknik för att bestråla enskilda celler under mikroskopisk observation med tung-Jon microbeams5, och har etablerat metoder för att aktivera riktade microbeam bestrålning av flera modell djur, såsom Nematoden Caenorhabditis elegans4,6, silkesmaskar7och Oryzias latipes (japansk medaka)8. Riktade microbeam bestrålning av de nematoder C. elegans gör den effektiv Nedslagning av specifika områden, såsom nerv ringen i regionen huvud, vilket bidrar till att identifiera rollerna för dessa system i processer såsom locomotion.
En metod för på-chip immobilisering av C. elegans individer utan behov av anestesi har utvecklats för att möjliggöra microbeam bestrålning4. Dessutom förbättrar mikroflödessystem chip används i den tidigare studie4, har vi nyligen utvecklat hydrofila, ion-genomträngliga, Polydimetylsiloxan (PDMS) mikroflödessystem chips, kallad mask ark (se Tabell för material), för immobilisera C. elegans individer9. Dessa består av ultra-tunn mjuk ark (tjocklek = 300 µm; bredd = 15 mm; längd = 15 mm) med flera (20 eller 25) raka mikroflödessystem kanaler (djup = 70 µm; bredd = 60 µm eller 50 µm; längd = 8 mm) på ytan (figur 1A-D). Mikroflödessystem kanaler är öppna och tillåter flera djur ska bifogas i dem samtidigt (figur 1E). Arken är motståndskraftig att tillåta mikroflödessystem kanalerna utvidgas (med ~ 10%, figur 1F), och elasticiteten gör djur till inlindas försiktigt. Också, på grund av egen adsorption kapacitet PDMS, djur kan förseglas i kanalerna genom att täcka ytan av bladet mask med en tunn täcka film, där djur inte trycks in kanalerna för kapsling. Genom att vrida locket filmar över, kan vi enkelt samla djuren.
Kanalerna ont inte maskar när de är inneslutas eller när de samlas. Dessutom lakan är gjorda av PDMS, som är i huvudsak hydrofoba, utan vätskeretention kan uppnås med specialinriktade hydrophilicitet till materialet. Den vätskeansamling och tjocklek är gynnsamma egenskaper av masken täcker. Vatten-retention kapacitet förhindrar uttorkning av djuren efter långvarig immobilisering och möjliggör långsiktiga observationer skall utföras.
Dessutom, som tidigare beskrivits9, är täcker endast 300 µm tjockt, så att tunga joner såsom koljoner (med en räckvidd på ca 1 mm i vatten) för att passera genom bladet omslutande djuren. Detta tillåter ion partiklarna ska identifieras och tillämpad stråldosen till mätas noggrant. Dessutom mask arken kan återanvändas och är därmed ekonomisk. Med konventionella injektion metod, djuren innesluten är ibland döda och de inte kan tas ur i Engelska kanalen. deras ägg kan också täpper till kanalerna. Detta gör chip oanvändbar. Chips är därför i princip disponibel och kostnads-förhållandet är dålig.
I detta dokument, beskriver vi i detalj en rad metoder för på-chip immobilisering av levande C. elegans individer använda mask ark. Genom locomotion analyser av djur 3 h efter på-chip immobilisering utvärderat vi lämpligt skydd filmen. Dessutom visade vi exemplen på chip immobilisering för både avbildning observationer och microbeam bestrålning.
Protocol
Representative Results
Discussion
På-chip immobilisering av C. elegans levande villkor med en hydrofila PDMS mikroflödessystem chip möjliggör effektiv riktad microbeam bestrålning av flera djur. Förenklar hantering och funktioner för att förhindra uttorkning gör detta system lämpliga för applikationer inte bara i microbeam bestrålning, men också i flera behavioral analyser. Dessa mask ark har redan kommersialiserats och lätt kan erhållas. Konventionella mikroflödessystem chips, såsom lukt marker, är associerade med problem inkl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Dr. Atsushi Higashitani för slags råd angående behandling av C. elegans och Drs. Yuya Hattori, Yuichiro Yokota och Yasuhiko Kobayashi för värdefulla diskussioner. Författarna vill tacka de Caenorhabditis Genetic Center för att tillhandahålla stammar av C. elegans och E. coli. Vi tackar besättningen på cyclotronen av TIARA på QST-Takasaki för deras hjälp med den bestrålning experimenten. Vi tackar Dr. Susan Furness för redigering av ett utkast till detta manuskript. Denna studie stöddes delvis av KAKENHI (Grant nummer JP15K11921 och JP18K18839) från JSPS att M.S.
Materials
| C. elegans wild-type strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | N2 | Wild-type C. elegans strain generally used in this study |
| C. elegans unc-119(e2498) III mutant strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | CB4845 | C. elegans strain only employed as an example of mutants with abnormal body shape |
| C. elegans transgenic strain HBR4 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | HBR4 | The genotype of this transgenic C. elegans strain is HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35:: unc-54–3’utr, unc-119(+)]V. This strain was only employed for imaging observation. |
| E. coli strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | OP50 | E. coli strain used as food for C. elegans |
| Worm Sheet IR (50/60) | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM17-0001 | Microfluidic chip with 25 straight 50/60-µm width channels used in all experiments and observation in this paper |
| Worm Sheet 60 | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0001 | Microfluidic chip with 20 straight 60 µm-width channels. This is sitable for adults 3-5 days after hatching at 20°C. |
| Worm Sheet 50 | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0002 | Microfluidic chip with 20 straight 50 µm-width channels. This is sitable for youg adults ~3 days after hatching at 20°C. |
| MICRO COVER GLASS | MATSUNAMI GLASS IND. LTD. | C030401 | Cover glass (thickness: 130-170 µm) used in locomotion assays in Protocol 3 |
| Polystyrene Film | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0001/ BCM18-0002 | Bundled items of Worm Sheets. PS filim (thickness: ~130 µm) used in locomotion assays in Protocol 3. |
| Polyester Film Lumirror | TORAY INDUSTRIES, INC., Tokyo, Japan | Lumirror T60 (t 125 µm) | PET filim (thickness: 125 µm) used in locomotion assays in Protocol 3 |
| IWAKI 60 mm/non-treated dish | AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). | 1010-060 | Non-treated dish used in incuvation of C. elegans in Protocol 1 |
| IWAKI 35 mm/non-treated dish | AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). | 1010-035 | Non-treated dish used in locomotion assays in Protocol 3 |
| Milli-Q | Merck, France | Ultrapure water | |
| Kimwipe S-200 | Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tokyo, Japan | 62020 | 120 mm x 215 mm; 200 sheets/ box |
| WormStuff Worm Pick | Genesee Scientific Corporation, CA, USA) | 59-AWP | Platina picker specilized for picking up C. elegans |
| Research Stereo Microscope System | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SZX16 | Micriscope used in all experiments and observation in this paper |
| Motorized Focus Stand for SZX16 | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SZX2-ILLB | This was used for bright field observation in Protocol 3-8. |
| Objective Lens (×1) | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SDFPLAPO1×PF | NA: 0.15; W.D.: 60 mm. This lends was used for bright field observation in Protocol 3-8. |
| Objective Lens (×2) | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SDFPLAPO2XPFC | NA: 0.3; W.D.: 20 mm. This lends was used for imaging observations. |
References
- Funayama, T., Hamada, N., Sakashita, T., Kobayashi, Y. Heavy-Ion microbeams-development and applications in biological studies. IEEE Transactions on Plasma Science. 36 (4), 1432-1440 (2008).
- Tanaka, A., Shikazono, N., Hase, Y. Studies on biological effects of ion beams on lethality, molecular nature of mutation, mutation rate, and spectrum of mutation phenotype for mutation breeding in higher plants. Journal of Radiation Research. 51 (3), 223-233 (2010).
- Ghita, M., Fernandez-Palomo, C., Fukunaga, H., Fredericia, P. M., Schettino, G., Bräuer-Krisch, E., Butterworth, K. T., McMahon, S. J., Prise, K. M. Microbeam evolution: from single cell irradiation to pre-clinical studies. International Journal of Radiation Biology. 94 (8), 708-718 (2018).
- Suzuki, M., Hattori, Y., Sakashita, T., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. Region-specific irradiation system with heavy-ion microbeam for active individuals of Caenorhabditis elegans. Journal of Radiation Research. 58 (6), 881-886 (2017).
- Funayama, T., Wada, S., Yokota, Y., Fukamoto, K., Sakashita, T., Taguchi, M., Kakizaki, T., Hamada, N., Suzuki, M., Furusawa, Y., Watanabe, H., Kiguchi, K., Kobayashi, Y. Heavy-ion microbeam system at JAEA-Takasaki for microbeam biology. Journal of Radiation Research. 49 (1), 71-82 (2008).
- Sugimoto, T., Dazai, K., Sakashita, T., Funayama, T., Wada, S., Hamada, N., Kakizaki, T., Kobayashi, Y., Higashitani, A. Cell cycle arrest and apoptosis in Caenorhabditis elegans germline cells following heavy-ion microbeam irradiation. International Journal of Radiation Biology. 82 (1), 31-38 (2006).
- Fukamoto, K., Shirai, K., Sakata, T., Sakashita, T., Funayama, T., Hamada, N., Wada, S., Kakizaki, T., Shimura, S., Kobayashi, Y., Kiguchi, K. Development of the irradiation method for the first instar silkworm larvae using locally targeted heavy-ion microbeam. Journal of Radiation Research. 48 (3), 247-253 (2007).
- Yasuda, T., Kamahori, M., Nagata, K., Watanabe-Asaka, T., Suzuki, M., Funayama, T., Mitani, H., Oda, S. Abscopal activation of microglia in embryonic fish brain following targeted irradiation with heavy-ion microbeam. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1-15 (2017).
- Suzuki, M., Sakashita, T., Hattori, Y., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration. Journal of Neuroscience Methods. 306, 32-37 (2018).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. 유전학. 77 (1), 71-94 (1974).
- Schwarz, J., Spies, J. P., Bringmann, H. Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus. Worm. 1 (1), 12-14 (2012).
- Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans. Experimental Biology. 204, 1757-1764 (2001).
- Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. C. elegans locomotory rate is modulated by the environment through a dopaminergic pathway and by experience through a serotonergic pathway. Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).
- Momma, K., Homma, T., Isaka, R., Sudevan, S., Higashitan, A. Heat-induced calcium leakage causes mitochondrial damage in Caenorhabditis elegans body-wall muscles. 유전학. 206 (4), 1985-1994 (2017).
- Kerr, R. A. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. 2, 1-13 (2006).
- Aubry, G., Lu, H. A perspective on optical developments in microfluidic platforms for Caenorhabditis elegans research. Biomicrofluidics. 8, 011301 (2014).
- Lumirror Catalog. TORAY Available from: https://www.toray.jp/films/en/products/pdf/lumirror.pdf (2018)
- Otobe, K., Itou, K., Mizukubo, T. Micro-moulded substrates for the analysis of structure-dependent behaviour of nematodes. Nematology. 6 (1), 73-77 (2004).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab on a Chip. 7 (11), 1515-1523 (2007).
- Lockery, S. R., Lawton, K. J., Doll, J. C., Faumont, S., Coulthard, S. M., Thiele, T. R., Chronis, N., McCormick, K. E., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. Artificial dirt: Microfluidic substrates for nematode neurobiology and behavior. Journal of Neurophysiology. 99 (6), 3136-3143 (2008).
- Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 5 (12), 1888-1902 (2010).
- Fehlauer, H., Nekimken, A. L., Kim, A. A., Pruitt, B. L., Goodman, M. B., Krieg, M. Using a microfluidics device for mechanical stimulation and high resolution imaging of C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (132), e56530 (2018).
