Мыши модель для оценки врожденный иммунный ответ инфекции стафилококк
Summary
Для реального времени обнаружения врожденной иммунной реакции на кожный ранения и инфекции стафилококк мышей описан подход. Путем сравнения LysM-EGFP мышей (которые обладают флуоресцентные нейтрофилов) с LysM-EGFP гибридных иммунодефицитных мыши штамм, мы заранее нашего понимания инфекции и разработки подходов к борьбе с инфекцией.
Abstract
Золотистый стафилококк Инфекции (S. aureus), в том числе метициллин резистентный пятна, являются огромным бременем на систему здравоохранения. С показатели заболеваемости S. aureus инфекции восхождение ежегодно есть спрос на дополнительные исследования в его патогенности. Животные модели инфекционных заболеваний углублению нашего понимания ответа хост возбудителя и привести к развитию эффективной терапии. Нейтрофилы играть главную роль в врожденный иммунный ответ, который управляет инфекции S. aureus , формируя абсцесс стены от инфекции и содействия бактериальных разминирования; количество нейтрофилов, которые проникнуть инфекция кожи S. aureus часто коррелирует с исход заболевания. LysM-EGFP мышей, которые обладают расширенной Зеленый флуоресцентный белок (EGFP) вставлен в регионе промоутер лизоцима М (LysM) (выражается главным образом нейтрофилами), когда используется в сочетании с целом животных в естественных условиях флуоресценции изображений (FLI) обеспечивают средства количественного нейтрофилов эмиграция неинвазивно и продольно в раненых кожи. При сочетании с биолюминесцентных S. aureus штамм и последовательным в естественных условиях весь животных биолюминесцентных изображений (BLI), это возможность продольно контролировать как динамика нейтрофилов найма, так и в естественных условиях бактериальной нагрузки на сайте инфекции в наркотизированных мышей от начала инфекции резолюции или смерти. Мышей более устойчивы к воздействию ряда факторов вирулентности производимые S. aureus , способствующих эффективному колонизации и инфекции в организме человека. Иммунодефицитных мышей предоставляют более чувствительных животных модель для изучения стойких S. aureus инфекций и терапии способность повысить innate иммунных реакций. Здесь мы характеризуют ответы в LysM-EGFP мышей, которые были выведены в MyD88-недостаточным мышей (LysM-EGFP × MyD88– / – мышей) наряду с одичал тип LysM-EGFP мышей расследовать S. aureus кожа раневой инфекции. Многоспектральный одновременного обнаружения включено исследование динамики нейтрофилов набора с помощью в естественных условиях FLI, бактериальной нагрузки с помощью BLI в естественных условиях и ранозаживляющие продольно и неинвазивно со временем.
Introduction
Золотистый стафилококк (S. aureus) приходится большинство инфекции кожи и мягких тканей (ИКМТ) в Соединенных Штатах1. Распространенность метициллин резистентный S. aureus (MRSA) за последние два десятилетия2, мотивации изучения механизмов сохранения и открытия новых стратегий лечения инфекций неуклонно растет. Стандарт медицинской помощи для MRSA инфекций является системной антибактериальной терапии, но MRSA становится все более устойчивыми к антибиотикам за время3 и эти препараты могут уменьшить пользу микрофлора хозяина, вызывая негативных последствий для здоровья, особенно в 4детей. Доклинические исследования изучили альтернативные стратегии для лечения MRSA инфекции5, но перевод этих подходов к клинике оказался сложным из-за появления факторов вирулентности, которые сорвать хост иммунных ответов6. Анализировать динамику хост возбудитель диска S. aureus ИКМТ, мы сочетаем неинвазивной и продольных индикация числа нейтрофилов набранных на раны кровать с кинетической мер бактериальной изобилия и ранение области.
Нейтрофилы являются наиболее распространенными циркулирующих лейкоцитов в организме человека и первый responders бактериальной инфекции7. Нейтрофилы являются необходимым компонентом для эффективного пребывания ответ против инфекции S. aureus вследствие их бактерицидные механизмов, включая производство реактивнооксигенных видов, протеаз, антимикробных пептидов и функциональных реакций включая фагоцитоза и нейтрофилов внеклеточного ловушку производства8,9. Человека пациентов с генетическими дефектами в нейтрофильные функции, такие как хроническая гранулематозная болезнь и Синдром Чедиака-Хигаси, показывают, повышенной восприимчивости к инфекции S. aureus . Кроме того, пациенты с генетическими (например врожденные нейтропении) и приобретенные (например, нейтропения, видели в химиотерапии больных) дефекты в нейтрофильные чисел также очень восприимчивы к инфекции S. aureus 10. Учитывая важность нейтрофилов в очистке инфекции S. aureus , укрепления их иммунной или настройки их число в пределах S. aureus поражения может оказаться эффективной стратегии в решении инфекции.
За последнее десятилетие трансгенных мышей с флуоресцентным нейтрофилов журналистами были разработаны для изучения их людьми11,12. Сочетая нейтрофилов репортер мышей с целом животных методы визуализации позволяет пространственно-временных анализ нейтрофилов в органах и тканях. При сочетании с биолюминесцентных штаммов S. aureus, это позволяет отслеживать накопление нейтрофилов в ответ на S. aureus изобилия и упорство в контексте бактериальной вирулентности факторов, которые прямо и косвенно возмущают нейтрофилов чисел в пораженной ткани13,14,,1516.
Мышей менее подвержены механизмов уклонения вирулентности и иммунной S. aureus , чем люди. Таким образом, мышах одичал типа не может быть идеальной моделью животных для изучения эффективности с учетом терапевтического лечения хронических S. aureus инфекции. MyD88-недостаточным мышей (т.е., MyD88– / – мышей), ослабленным мыши штамм, который не хватает функциональной интерлейкина-1 рецепторов (IL-1R) и Толл подобный рецептор (TLR) сигнализации, шоу подверженности заражению S. aureus , по сравнению с мышах одичал тип17 и ухудшение оборота нейтрофилов к сайту S. aureus инфекции кожи18. Разработка мыши штамм, который обладает репортером флуоресцентный нейтрофилов в MyD88– / – мышей предоставляет альтернативную модель для исследования эффективности терапии для лечения инфекции S. aureus , по сравнению с текущей нейтрофилов Репортер мышей.
В этом протоколе мы характеризуют инфекции Стафилококк золотистый в ослабленным мышей– / – × MyD88 LysM-EGFP и сравнить время курс и резолюции инфекции с LysM-EGFP мышей. LysM-EGFP × MyD88 мышей– / – развитие хронической инфекции, которые не удалось решить, и 75% поддаваться инфекции после 8 дней. Значительный дефект в первоначальном наборе нейтрофилов происходит более 72 ч воспалительной стадии инфекции, и 50% меньшее количество нейтрофилов набирать на последней стадии инфекции. Повышенная восприимчивость × LysM-EGFP, MyD88– / – мышей делает это особое напряжение строгий доклинических модель для оценки эффективности новых терапевтических методов таргетинга инфекции S. aureus , по сравнению с текущей модели Используйте мышь одичал типа, особенно техники, стремясь повысить врожденный иммунный ответ против инфекции.
Protocol
Representative Results
Discussion
S. aureus инфекции модели, которые используют биолюминесцентных S. aureus инфекции в флуоресцентные нейтрофилов репортер мыши в сочетании с передовыми методами всего животных в естественных условиях оптических изображений выдвинули наши знания о врожденной иммунного ответа на инф…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана национальными институтами из здравоохранения грантов R01 AI129302 (чтобы S.I.S.) и программу обучения в области фармакологии: от скамьи в постели на UC Дэвис (низ T32 GM099608 до L.S.A). Молекулярная и геномных Imaging (CMGI) на университета Калифорнии Дэвис условии превосходно технологическую поддержку.
Materials
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352059 | |
| 6mm Disposable Biopsy Punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| Bioluminescent S. aureus | Lloyd Miller, Johns Hopkins | ALC 2906 SH1000 | |
| Bovine Blood Agar, 5%, Hardy Diagnostics | VWR | 10118-938 | |
| Buprenoprhine hydrochloride injectable | Western Medical Supply | 7292 | 0.3 mg/mL |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labratory | 000664 | |
| Chloramphenicol (crystalline powder) | Fisher BioReagents | BP904-100 | |
| DPBS (1X) | Gibco | 14190-144 | |
| Insulin Syringes | Becton, Dickson and Company | 329461 | .35 mm (28 G) x 12.7 mm (1/2'') |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| Living Image Software – IVIS Spectrum Series | Perkin Elmer | 128113 | |
| LysM-eGFP Mice | Thomas Graff Albert Einstein College of New York | NA | |
| Microvolume Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| MyD88 KO Mice | Jackson Labratory | 009088 | |
| Non-woven sponges | AMD- Ritmed Inc | A2101-CH | 5 cm x 5 cm |
| Povidone Iodine 10% Solution | Aplicare | 697731 | |
| Prism 7.0 | GraphPad Software | License | |
| Tryptic Soy Broth | Becton, Dickson and Company | 211825 |
References
- Moran, G. J., et al. Methicillin-Resistant S. aureus Infections among Patients in the Emergency Department. New England Journal of Medicine. 355 (7), 666-674 (2009).
- Suaya, J. A., et al. Incidence and cost of hospitalizations associated with Staphylococcus aureus skin and soft tissue infections in the United States from 2001 through 2009. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 296 (2014).
- Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. P & T : a Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).
- Blaser, M. J. Antibiotic use and its consequences for the normal microbiome. Science. 352 (6285), 544-545 (2016).
- Hilliard, J. J., et al. Anti-Alpha-Toxin Monoclonal Antibody and Antibiotic Combination Therapy Improves Disease Outcome and Accelerates Healing in a Staphylococcus aureus Dermonecrosis Model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 299-309 (2015).
- Proctor, R. A. Recent developments for Staphylococcus aureus vaccines: clinical and basic science challenges. European Cells & Materials. 30, 315-326 (2015).
- Mölne, L., Verdrengh, M., Tarkowski, A. Role of Neutrophil Leukocytes in Cutaneous Infection Caused by Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 68 (11), 6162-6167 (2000).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Borregaard, N. Neutrophils, from Marrow to Microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Miller, L. S., Cho, J. S. Immunity against Staphylococcus aureus cutaneous infections. Nature Reviews Immunology. 11 (8), 505-518 (2011).
- Hasenberg, A., et al. Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes. Nature Methods. 12 (5), 445-452 (2015).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Falahee, P. C., et al. α-Toxin Regulates Local Granulocyte Expansion from Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Staphylococcus aureus-Infected Wounds. Journal of immunology. 199 (5), 1772-1782 (2017).
- Kim, M. -. H., et al. Dynamics of Neutrophil Infiltration during Cutaneous Wound Healing and Infection Using Fluorescence Imaging. Journal of Investigative Dermatology. 128 (7), 1812-1820 (2008).
- Liese, J., Rooijakkers, S. H. M., Strijp, J. A. G., Novick, R. P., Dustin, M. L. Intravital two-photon microscopy of host-pathogen interactions in a mouse model of Staphylococcus aureus skin abscess formation. Cellular Microbiology. 15 (6), 891-909 (2013).
- Bogoslowski, A., Butcher, E. C., Kubes, P. Neutrophils recruited through high endothelial venules of the lymph nodes via PNAd intercept disseminating Staphylococcus aureus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2449-2454 (2018).
- Takeuchi, O., Hoshino, K., Akira, S. Cutting Edge: TLR2-Deficient and MyD88-Deficient Mice Are Highly Susceptible to Staphylococcus aureus Infection. The Journal of Immunology. 165 (10), 5392-5396 (2000).
- Miller, L. S., et al. MyD88 Mediates Neutrophil Recruitment Initiated by IL-1R but Not TLR2 Activation in Immunity against Staphylococcus aureus. Immunity. 24 (1), 79-91 (2006).
- Macedo, L., et al. Wound healing is impaired in MyD88-deficient mice: a role for MyD88 in the regulation of wound healing by adenosine A2A receptors. The American Journal of Pathology. 171 (6), 1774-1788 (2007).
- Cho, J. S., et al. Neutrophil-derived IL-1β Is Sufficient for Abscess Formation in Immunity against Staphylococcus aureus in Mice. PLoS Pathogens. 8 (11), e1003047 (2012).
- Granick, J. L., et al. Staphylococcus aureus recognition by hematopoietic stem and progenitor cells via TLR2/MyD88/PGE2 stimulates granulopoiesis in wounds. Blood. 122 (10), 1770-1778 (2013).
- Kim, M. H., et al. Neutrophil survival and c-kit+-progenitor proliferation in Staphylococcus aureus-infected skin wounds promote resolution. Blood. 117 (12), 3343-3352 (2011).
- Foster, T. J. Immune evasion by staphylococci. Nature Reviews Microbiology. 3 (12), 948-958 (2005).
- Gordon, R. J., Lowy, F. D. Pathogenesis of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Infection. Clinical Infectious Diseases. 46 (Supplement_5), S350-S359 (2008).
- Cho, J. S., et al. Neutrophil-derived IL-1β Is Sufficient for Abscess Formation in Immunity against Staphylococcus aureus in Mice. PLoS Pathogens. 8 (11), e1003047-e1003020 (2012).
- Bernthal, N. M., et al. A mouse model of post-arthroplasty Staphylococcus aureus joint infection to evaluate in vivo the efficacy of antimicrobial implant coatings. PLoS ONE. 5 (9), e12580 (2010).
- Plaut, R. D., Mocca, C. P., Prabhakara, R., Merkel, T. J., Stibitz, S. Stably Luminescent Staphylococcus aureus Clinical Strains for Use in Bioluminescent Imaging. PLoS ONE. 8 (3), e59232 (2013).
- Dillen, C. A., et al. Clonally expanded γδ T cells protect against Staphylococcus aureus skin reinfection. The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1026-1042 (2018).
