경도 형태 및 생리 적인 광학 일관성 단층 촬영을 사용 하 여 3 차원 종양 Spheroids의 모니터링

Summary

광학 일관성 단층 촬영 (10 월), 3 차원 영상 기술, 모니터링 하 고 다세포 종양 spheroids의 성장 활동 특성 사용 되었다. 접근, 및 내장 광 감쇠 대비에 따라 spheroids에서 레이블 없는 죽은 조직 검출 복을 사용 하 여 종양 spheroids의 정확한 체적 정량화 시연 했다.

Abstract

종양 spheroids 암 연구 및 항 암 신약의 3 차원 (3D) 세포 문화 모델 개발 되었습니다. 그러나, 현재, 높은 처리량 modalities 이미징 밝은 필드 또는 형광 탐지를 활용 하 여 수 없습니다 제한 된 빛이 침투, 형광 염료의 확산으로 인해 종양 회전 타원 체의 전반적인 3D 구조를 해결 하 고 깊이-resolvability. 최근, 우리 실험실 광학 일관성 단층 촬영 (OCT), 레이블 및 비 파괴적인 3D 96 잘 접시에 다세포 종양 spheroids의 경도 특성 분석을 수행 하려면 양식 적임 이미징의 사용을 시연 했다. 10 월은 높이 약 600 µ m까지 성장 하는 종양 spheroids의 3D 형태학 상과 생리 적인 정보를 얻는 능력. 이 문서에서는, 높은 처리량 (HT-10 월) 10 월 이미징 시스템을 전체 다 잘 판 검사 및 종양 spheroids의 3D 10 월 데이터를 자동으로 가져옵니다 설명 합니다. 프로토콜에 HT-10 월 시스템 및 건설 지침의 세부 사항을 설명합니다. 3D 10 월 데이터에서 하나 3d 렌더링은 회전 타원 체의 전체 구조를 시각화할 수 및 직교 분할 영역 크기와 볼륨의 형태학 정보에 따라 종양 회전 타원 체의 경도 성장 곡선을 특성화 고의 성장 모니터링 광학 내장 감쇄 대비에 따라 종양 회전 타원 체에 죽은 셀 영역입니다. 우리는 약물 검사로 biofabricated 샘플을 특성화에 대 한 HT-10 월에는 높은 처리량 이미징 형식으로 사용할 수 있습니다 보여줍니다.

Introduction

암은 세계¹죽음의 두 번째 주요 원인. 암을 대상으로 하는 약물을 개발 하는 것은 환자에 대 한 중요 한 중요성 의입니다. 그러나, 그것은 새로운 항 암 약의 90% 이상 효능과 임상 실험²에서 예기치 않은 독성의 부족 때문에 개발 단계에서 실패 추정. 이유의 일부는 약 발견² 의 다음 단계에 대 한 복합 효능 및 독성의 예측 값이 제한 된 결과 제공 하는 복합 심사에 대 한 간단한 2 차원 (2D) 세포 문화 모델의 사용에 표시 될 수 있습니다. ^{, 3 , 4}. 최근 3 차원 (3D) 종양 회전 타원 체 모델 항 암 약물 발견^{3,,45 에 대 한 임상 관련 생리 및 약리 데이터를 제공 하도록 개발 되었습니다 6,7,,}

Protocol

1입니다. 셀의 준비

1. 자격 갖춘된 공급 업체에서 셀 라인을 얻을.
   참고: 셀의 셀 라인에서 문화 미디어 또는 기판 (Matrigel 같은 지하실 막 매트릭스)의 도움으로 회전 타원 체를 형성할 수 있다 확인 하십시오. ⁹ 문학 또는 검사에 대 한 사전 실험의 한 라운드를 수행.
2. 셀 라인 공급 업체에서 제공 하는 특정 절차에 따라 냉동된 셀 동 일반 절차 다른^43을찾을 수 있습니다.
3. 25 cm² 문화 플라스 크에 1-2 구절에 대 한 셀을 문화. 셀 3D 세포 배양에 사용할 수 있습니다.
4. 매일 세포의 건강 상태를 모니터링 하 고 표준 조건 (37 ° C, 5% CO₂, 95% 습도)에서 인큐베이터에 그들을 유지 하는 것. 필요에 따라 미디어를 새로 고칩니다.
   주: DMEM (4.5 g/L 포도 당), 1% 항생제-antimycotic, 10% 태아 둔감 한 혈 청의 문화 매체 구성 됩니다. Subculture 셀 문화 플라스 크에서 합류를 도달 하기 전에. 공급 업체에서 제공 하는 셀 문화 지침을 따릅니다. 일반 절차 elsehwhere⁴⁴찾을 수....

Results

96 잘 접시에 Spheroids의 높은 처리량 광학 일관성 단층 촬영 화상 진 찰

그림 3 HT-10 월 3 일에 HCT 116 종양 spheroids 96 잘 접시의 검사의 결과 전시 한다. 전체 접시의 순차 스캔 오른쪽 아래 우물 (H12)에서 시작합니다. 그림 3B HT-10 월 시스템의 소프트웨어 구현에 대 한 흐름 차트가 표시 됩니다. 기다려야 다음 음, ~ 2 접시 이동 후 한 회전 타원 체 데이터 수집 하 고 처리 했다, 휴식, 다음 회전 타원 체 데이터를 수집 하는 회전 타원 체를 허용 하는 s. 각 10 월 데이터 1024 복, 2.3 m m³x 0.84 x 1.0의 실제 볼륨에 대응 x 400 x 400으로 구성 됩니다. <.......

Discussion

종양 활동은 매우 그것의 형태학 상 구조에 관련이 있다. 유사한 특성 성장 곡선 2D 셀 문화에 대 한 모니터링, 3D 종양 spheroids에 대 한 성장 곡선을 추적 이다 또한 다른 세포에 대 한 장기적인 회전 타원 체 성장 동작에 대 한 기존의 접근. 특히, 우리 종양 저하 또는 직접 성장 곡선에 반영 하는 종양 재 성장을 분석 하 여 약물 응답을 특징 수 있습니다. 따라서, 3 차원 종양 spheroids, 크기, 볼륨, 성장 곡선, 파생 등의 정량적 평가 종양 spheroids의 특성화 및 복합 효과의 평가에 매우 중요입니다. 현재, 밝은 분야, 위상 대조를 기반으로 플랫폼을 이미징 또는 형광 이미징 일상적인 이미징 및 형태학의 분석 또는 3D 종양 spheroids^{8,,918의 기능에 대 한 설립 되었습니다.}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Custom Spectral Domain OCT 이미징 시스템			우리 실험실에서 개발된
Superluminescent Diode (SLD)	Thorlabs	SLD1325	light source
2× 2 단일 모드 융합 광섬유 커플러, 50:50 분할 비율	AC Photonics	WP13500202B201
Reference Arm
Lens Tube	Thorlabs
Adapter	Thorlabs
Collimating Lens	Thorlabs	AC080-020-C
초점 렌즈	Thorlabs
Kinematic Mirror Mount	Thorlabs
Mirror	Thorlabs
1D Translational Stage	Thorlabs
연속 중립 밀도 필터	Thorlabs
보행자 포스트	Thorlabs
클램핑 포크	Thorlabs
샘플 암
렌즈 튜브	Thorlabs
어댑터	Thorlabs
시준 렌즈	Thorlabs	AC080-020-C
검류계	Thorlabs
릴레이 렌즈	Thorlabs	AC254-100-C	망원경 설정을 위한 두 개의 릴레이 렌즈
삼각형 거울 마운트	Thorlabs
거울	Thorlabs
목표	Mitutoyo
보행자 포스트	Thorlabs
클램핑 포크	Thorlabs
편광 컨트롤러	Thorlabs
30mm 케이지 마운트	Thorlabs
Cage Rod	Thorlabs
Stage
3D 전동 번역 스테이지	Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd.
2D 틸팅 스테이지
회전 스테이지
플레이트 홀더			3D 프린팅
<강력한>분광계
렌즈 튜브	Thorlabs
어댑터	Thorlabs
시준 렌즈	Thorlabs	AC080-020-C
그레이팅	와사치		G = 1145 lpmm
F-θ 렌즈	Thorlabs	FTH-1064-100
InGaAs 라인 스캔 카메라	센서 무제한	SU1024-LDH2
Name	Company	카탈로그 번호	코멘트
Cell Culture Component
HCT 116 세포주	ATCC	CCL-247
세포 배양 플라스크	SPL Life Sciences	70025
피펫	Fisherbrand	14388100
피펫 팁	Sorenson Bioscience	10340
Gibco GlutaMax DMEM	Thermo Fisher Scientific	10569044
소태아 혈청, 인증, 미국 원산지	Thermo Fisher Scientific	16000044
항생제-항진균제(100X)	Thermo Fisher Scientific	15240062
Corning 96웰 투명 원형 바닥 초저 부착 마이크로플레이트	Corning	7007
Gibco PBS, pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010023
Gibco Trypsin-EDTA (0.5%)	Thermo Fisher Scientific	15400054
Forma Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators	Thermo Fisher Scientific	3120
장갑	VWR	89428-750
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793
전사 피펫	Globe Scientific	138080
Centrifuge	Eppendorf	5702 R	15 mL 튜브 원심분리기
	NUAIRE	AWEL CF 48-R	96웰 플레이트를 원심분리하는 경우
현미경	Olympus
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
조직학 & IHC
디지털 슬라이드 스캐너	Leica	Aperio AT2	고해상도 조직학적 이미지 획득
조직학 서비스	Histowiz		종양의 조직학적 및 면역조직학적 염색을 위한 서비스 요청 스페로이드
Name	Company	카탈로그 번호	코멘트
상업 OCT 목록
SD-OCT 시스템	Thorlabs	Telesto 시리즈
	Wasatch Photonics	WP OCT 1300 nm
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
데이터 분석용 소프트웨어
Basic Image Analysis	NIH	ImageJ	Fiji도 작동합니다.
3D 렌더링	Thermo Fisher Scientific	Amira	상용 소프트웨어. 옵션 1
: 3D 렌더링	비트 플레인	Imaris	상용 소프트웨어. 옵션 2.
C++로 맞춤 개발된	OCT 수집 소프트웨어에
단계 통제	: 베이징 Mao Feng 광전자 공학 기술 Co., 주식 회사.	MRC_3	OCT 처리 소프트웨어
		OCT 수집	. GPU를 활용합니다. 사용자 지정 OCT 수집 코드에 통합되었습니다.
MATLAB에서 사용자 정의 개발한	형태학적 및 생리학적 분석